在HPLC方法开发中，分离度达不到要求是我们常遇到且需要解决的问题。对于这个问题，已经有非常多的研究。经典的理论模型是1999年由Zhao等人提出，如下图中的公式所示，分离度由柱效、选择性和保留因子决定。从图中的拟合曲线可以看出，改变选择性是改善分离度的最容易出奇制胜的方法。
图1 分离度及其决定因素图
那么，什么是选择性呢？简单、通俗的理解是化合物在特定的色谱条件（固定相、流动相和温度等）下，与固定相和流动相的作用总和的差异，差异越大，选择性也就越大，对分离度的改善也越大。星谱实验室完成了一个非常有意思的类似物的分析方法开发，可以展示选择性的重要性，为我们方法开发工作提供启发。待分离的三个化合物（A，B，C）的结构如2所示：
图2 三个待分析物的结构
我们分析并用红色标记了三个化合物的结构上基团的差异以及这些基团可能与固定相和流动相之间发生作用力，如图3所示：
图3 三个化合物的结构差异及差异基团的作用力
从图3可以看出，三个化合物之间存在氢键，偶极-偶极和pi-pi作用的差异，因此可以基本确定判断：
1. 当以甲醇和乙腈作为有机相时，选择性的差异会比较明显；
2. 由于化合物中的基团（包括R1和R2）在常用色谱柱的耐受的pH范围内都是非电离状态，因此无需过多考察流动相的pH；
3. 可以选择能够识别这些差异的色谱柱来优化分离；
4. 这些基团本身的疏水性也有差异。
因此，我们以C18柱为色谱柱选择的起点，选用Horizon C18这款经典的色谱柱，考察甲醇和乙腈作为流动相中的强溶剂时的分离情况，结果如图4所示：
图4 考察乙腈和甲醇作为流动相强洗脱溶剂的图谱
从分离结果中可以看出，在两种溶剂中，三个化合物体现出了非常大的选择性差异，总体在甲醇中三者的分离效果更好。我们通常可能会在此基础上，用Horizon C18，通过调节甲醇的比例来优化方法，实现三者的分离。但是对于这三个化合物，我们进行多次甲醇比例的优化仍然无法获得三者足够安全的分离度，如图5所示：
图5 使用Horizon C18考察不同比例的甲醇的图谱
接下来我们从色谱柱固定相的选择性的角度来考虑选择能够识别这三个化合物的差异的色谱柱，我们选择了Horizon C18/PFP（C18和PFP同时键合，可以提供C18的作用的同时还可以提供PFP的pi-pi作用和氢键作用（受体）和偶极-偶极作用）以及Horizon C18/AR (C18和Phenyl同时键合，可以提供C18的作用的同时还可以提供Phenyl的pi-pi作用)，选择和Horizon C18同样的流动相，结果如下：
图6 考察三款选择性互补的色谱柱的谱图
可以看到，Horizon C18/AR相对C18，可以改善A和B的分离，而Horizon C18/PFP可以进一步改善A和B的分离，不得不惊叹色谱柱选择性的威力！在这个基础上，我们实验室很快就开发出了足够稳健的分析方法。
图7 Horizon C18/PFP和C18/AR所能提供的作用力汇总
全文总结
我们通过对三个有趣的化合物的HPLC分析方法开发，剖析化合物之间的基团差异以及这些差异带来的可能的作用力的差异，通过后续的实验，也展示了流动相（甲醇和乙腈）和色谱柱固定相的选择性的重要性。希望可以给我们做方法开发的用户朋友带来启发。
