寡核苷酸
新冠疫情中，一般采用如聚合酶链反应（PCR）快速检测是否存在 SARS-CoV-2 。PCR 检测的目标是由亚磷酰胺为主体合成的核苷酸或者短链 RNA/DNA 分子。 亚磷酰胺单体的排列、化学改性以及数量赋予 RNA/DNA 序列特定靶向，应用于疾病筛查、生物医学研究和刑事等领域。在过去几年，寡核苷酸应用与日俱增，满足质量要求的供应链日趋紧张。在 cGMP 环境下，对合成寡核苷酸的初始物料，在物料接收处进行鉴别，以保持质量标准。这是在寡核苷酸生产流程中防止原料掺假或引入劣质原料的道防线。
本文介绍安捷伦 vaya 手持拉曼用于鉴别合成寡核苷酸的商品化物质---亚磷酰胺。实验证明，在 cGMP 环境下 Vaya 可穿透透明或不透明容器有效鉴别和区分生物制药的原辅料。
Agilent Vaya 手持拉曼采用空间位移拉曼（SORS）技术，可以直接穿透透明和不透明的容器鉴别原辅料（如图 1 ），还可以准确区分类似物，例如非对映异构体、位置异构体、多晶型等。
图 1 . Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶鉴别寡核苷酸初始物料
Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶测试的五种亚磷酰胺（采购于 Sigma Aldrich），测试谱图如下：
a. DMT-dA(bz) Phosphoramidite
b. DMT-dT Phosphoramindite
c. DMT-dG(ib) Phosphoramidite
d. DMT-dA(bz)-CPG
e. DMT-2’O-Methyl-rA(bz) Phosphoramidite
图 2 . 5 种亚磷酰胺的拉曼谱图
从图 2 看出，c 和 d 的两种亚磷酰胺在 1000-1500cm-1 范围有明显特征峰，容易和其他四种亚磷酰胺区分，而其他三种亚磷酰胺就很相似，对于拉曼鉴别就具有一定挑战。Vaya 手持拉曼采用双参数 R2 和 LMC 同时评判测试结果是 Pass 还是 Fail ，相比单一参数评判，更容易区分相似组分。更重要的是，Vaya 在建模过程中还具备添加相似组分的功能，让其区分相似组分的能力更加强大。
建模时不添加相似组分
如图 3 是建模不添加相似组分的 5 种亚磷酰胺的交叉验证结果。直接隔着棕色玻璃瓶分别对每一种亚磷酰胺建模（此时没有将其他 4 种亚磷酰胺作为相似组分添加入模型），再用每一个模型分别去验证 5 种亚磷酰胺。理想情况应该是，只有每一个模型验证自身时，结果是 Pass ，而验证其他四种亚磷酰胺时，结果均是 Fail 。实际结果表明，在不添加相似组分时，由于其中几种亚磷酰胺相似度太高，Vaya 不能稳定的区分这 5 种亚磷酰胺。于是下一步就在建模中采用添加相似组分的功能。
图 3 . 不添加相似组分时 5 种亚磷酰胺的交叉验证结果
建模时添加相似组分
如图 4 是采用添加相似组分功能后 5 种亚磷酰胺的交叉验证结果。直接隔着棕色玻璃瓶分别对每一种亚磷酰胺建模，并将其他 4 种亚磷酰胺作为相似组分添加入模型中，启动更智能的算法，再用每一个模型分别去验证 5 种亚磷酰胺。结果发现，每种亚磷酰胺模型只在验证测试自身时，结果是 Pass，验证测试其他四种物质时都显示 Fail。说明在采用添加相似组分功能后，Vaya 可以直接隔着棕色玻璃瓶稳定鉴别区分亚磷酰胺物质。
图 4 . 添加相似组分时 5 种亚磷酰胺的交叉验证结果
结语
安捷伦 Vaya 手持拉曼，无需打开容器，在物料接收处，只需几秒即可直接验证亚磷酰胺，快速判断其是否被装错。Vaya 也同样适用于生物制药其他原辅料的验证。
