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原来 C18 柱有这么多选择技巧！
天津谱祥伟业科技有限公司
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2022/6/14 9:40:04
在药物分析中高效液相色谱法用得非常普遍, 而色谱柱的选择直接影响实验结果与药物的质量控制。不同C18色谱柱的保留行为千差万别, 选择适宜的色谱柱对分析样品至关重要。以C18色谱柱的内部化学键合相为切入点, 介绍C18色谱柱的差异, 并综述在不同的pH环境、流动相极性、药物极性等条件下以及根据色谱柱的分类系统选择合适的键合相, 为如何正确快速的选择C18色谱柱提供参考。
高效液相色谱（HPLC）法选择性高、灵敏度高、分析速度快，而且大部分可以溶解的药物能用该法分析，所以该技术已经成为药物分析的方法。色谱柱是高效液相分离系统的中重要的环节，业内常把色谱柱比喻为液相色谱的心脏，因为色谱柱的类型决定了色谱系统的性质，色谱柱的粒径和长度影响了分析时间和分析效率。氨基柱、苯基柱、氰基柱等正相色谱柱和C18、C8等反相色谱柱是药物分析与评价工作中常见的两类色谱柱。以碳十八硅烷化学键合硅胶固定相（C18或ODS）的反相色谱出色地完成了液相色谱分析任务，而且与其他色谱相比，C18反相色谱有明显的优势，它可直接进样分析水溶性样品，因而适用范围广，被誉为“标准固定相分离模式。各国药典涉及使用液相色谱法进行检测的品种当中，C18色谱柱作为固定相应用广泛。目前市场上有600多种C18色谱柱，且不断有新的色谱柱出现。采用不同的C18色谱柱分析具体样品时，保留时间、溶质之间的分离情况、出峰顺序等色谱柱的保留行为都可能出现较大的差异、《美国药典》（USP）、《欧洲药典》和《日本药局方》对色谱柱的规定比较详细，除注明填料所属的大类别外，通常还给出色谱柱的内径、长度、粒径、比表面积等信息，有些品种还会直接注明色谱柱的厂家。在美国药典委员会网站可查询到USP推荐的色谱柱品牌与型号。而《中国药典》仅指明色谱柱的填料大类，如十八烷基硅烷键合硅胶。由于《中国药典》缺少选择色谱柱方面的详细指导，使得药典推荐方法的执行遇到困 难。在参考文献执行某一HPLC方法时，当无法获得文献中所用色谱柱时，需要寻求选择性相似的色谱柱代替。十八烷基硅烷（常被称为ODS或C18）是初期的键合固定相之一，C18是具有烷基链的硅烷化剂与硅胶表面的硅醇基反应制得的键合相。因为使用了共价键和的方式将烷基链紧紧固定在硅胶表面，所以烷基链不会被流动相冲洗掉，作为色谱固定相稳定发挥作用。C18色谱柱因键合方式的不同、粒径的不同、长度的不同，内径的差异等多方面因素，呈现出不同选择性。这样，在市场上就出现了数百种具有不同分离选择特性的C18色谱柱。2010年版《中国药典》增加了麦白霉素A有关物质及其组分的检查，但并未要求C18色谱柱的型号和品牌。C18色谱柱能对麦白霉素A中各组分能达到较好分离。不同C18色谱柱之间的分离度差别较大，影响药物有关物质和组分的测定。相同规格的C18色谱柱由于生产厂家的不同也会产生较大的分析差异。用5种相同规格、不同生产厂家的C18色谱柱测定胸腺法新有关物质，结果5种C18色谱柱表现的分离度和保留时间差异很大。有的色谱柱表现的分离效果甚至不符合药典的要求。用3种同规格不同品牌的C18色谱柱考察了不同厂家色谱柱对注射用氢化可的松琥珀酸钠与相关物质分离的效果。其中两种C18色谱柱出峰顺序不符合《中国药典》规定。可见氢化可的松琥珀酸钠对于色谱柱固定相的选择性很强。C18色谱柱内部填料的粒度、孔径、键合量及填充的工艺、技术等差异是上述现象的主要原因。分析化学中可以根据pH环境、流动相极性、色谱柱的分类系统、药物极性等来选择合适的C18色谱柱。因为在药物分析中，药物的极性一般是无法改变的，所以下文主要介绍根据pH环境、流动相极性、色谱柱的分类系统来选择C18色谱柱。对于传统的C18色谱柱，pH值使用范围通常为2～7，因为pH值高于8时C18固定相会受到限制。由于残余硅羟基的存在，易对碱性化合物造成不可逆吸附，造成峰拖尾，影响分离与分析。pH值太低则会使键合的烷基脱落，而且对成分的分离达不到要求。为了改善C18色谱柱在低pH值时的稳定性，有人提出了空间位阻方法。空间位阻作用是指连接较大基团，立体阻碍溶质基团进攻硅醇基，使硅氧烷能够再生，提高了化学键合固定相抗水解的能力。还有人制备了侧链中含有异丙基或异丁基的C18化学键合固定相。该固定相由于引入了较大的侧链基团，立体阻碍了残留硅醇基与溶质之间的相互作用，在低pH值条件下能够保持稳定，这种化学键合固定相更适合酸性物质的分离。Zorbax Stable Bond C18色谱柱就使用了空间位阻技术，其使用单官能团硅烷，具有较大的二异丁基（SB-C18）侧链基团，空间位阻关键的硅氧烷键合到硅胶表面，以避免在低pH值条件下水解破坏，在酸性流动相条件下提供良好的稳定性和重现性。因此，Stable Bond色谱柱成为低pH值方法开发的。在方法开发初期，若选定流动相为酸性，可选择此类色谱柱作。制造快速分离碱性化合物的化学键合相一直是研究热点。双齿键合固定相的每个硅烷化分子中含有两个硅原子，两个硅原子之间以-O-或-CH2-CH2等基团连接，每个硅原子含有1个C18官能团。它的环状结构无论在低pH值条件下，还是高pH值条件下均显示了较高的稳定性和满意的柱效。与传统的单齿化学键合相相比，这种化学键合固定相的优点是在低、中、高pH值时都有很好的稳定性。使用C18双齿化学键合固定相的商品柱有Zorbax Extend-C18色谱柱，其耐受pH值达11.5，特别适合在高pH值的流动相条件下对强碱性化合物进行有效的色谱分离、Janina等在开发普鲁卡因有关物质的药物分析方法中，对比8种C18色谱柱，选择了耐受pH值范围较大的Zorbax Ex tend C18色谱柱。分析样品与杂质均为碱性，使用Zorbax Extend C18使各杂质与组分间分离好。若碱性物质间的分离效果不佳，可以考虑使用上述键合相填料的C18色谱柱极性基团嵌入化学键合相技术是分离极性较大物质的一个方法，这种键合相可以在强极性流动相条件下长期使用。Symmetry Shield TM RP C18色谱柱是嵌入了氨基甲酸酯基团的反相色谱柱，Sunil等]用该固定相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对盐酸小檗碱进行HPLC分析。实验中流动相为强极性水，盐酸小檗碱为碱性化合物。通过对比其他色谱柱，上述色谱柱的理论塔板数高，没有拖尾现象。嵌入了氨基甲酸酯基团的键合相不但阻止了残留硅醇基与碱性化合物之间的作用，而且提高了水润湿性，特别适合在使用极性流动相情况下分离碱性物质。中草药成分较为复杂，含有较多极性非极性等组分。在研究血畅宁组方中总皂苷的HPLC法分析，采用Fusion-RP C18色谱柱，在强极性流动相条件下，各类极性不同的皂苷组分间达到好的分离。Fusion-RP C18色谱柱由于键入了极性基团，而且拥有疏水链，其可以在100%的水相流动相条件下长时间运转，特别适合于在强极性条件下分析含有极性和非极性化合物的混合物。重复某一方法，但由于某种原因无法获得目标色谱柱时，需要选择与目标色谱柱有相似保留行为的色谱柱来开展实验。通过对色谱柱的保留行为进行表征，可以快速选择出相似色谱柱。反相色谱柱的方法从20世纪70年代开始就一直被广泛研究。该色谱柱分类系统可以表征色谱柱的保留行为，进而可以进行色谱柱的选择和对比。不同C18色谱柱之间的保留行为差别很大，选择合适的C18是药物分析工作的重点。需要一种科学的方法对色谱柱进行表征和分类，然后才可以进行快速的选择。目前，各类新型的C18键合相层出不穷，从键合相类型方面对其分类较为困难。而且，色谱柱的选择行为与键合相的类型关系不大。所以本文只是论述了在酸碱情况下如何选择分离效果较好的C18键合相及强极性条件下如何选择耐用的C18键合相，并未就此进行色谱柱的分类归纳。
