人牙周膜干细胞（hPDLSCs）可以从牙周膜中分离出来，牙周膜是牙根和相邻牙槽骨之间的连接纤维组织。迄今为止，hPDLSCs 已表现出间充质干细胞（MSC）的特征，因为它们具有自我更新和分化的潜力。hPDLSCs 的治疗潜力不仅体现在牙周组织中，还体现在其他组织中，如牙槽骨。
从免疫调节的角度来看，hPDLSCs 具有显著的特征，使其能够逃避免疫识别，抑制激活的免疫细胞功能并在组织再生过程中调节炎症细胞因子。旁分泌免疫抑制细胞因子，包括吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β1（TGF-β1），具有显著的免疫调节作用，可调节免疫细胞的行为。
转化生长因子β1（TGF-β1) 在 MSCs 和牙周韧带（PDL）细胞中组成型表达。它在激活前以潜伏形式分泌，与细胞膜和细胞外基质（ECM）蛋白结合。除了调节组织稳态外，TGF-β1 可以抑制 T 细胞增殖和活化以及促进调节性 CD4+ T（Treg）细胞的分化。吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）是催化 L-Tryptophan 向 N-甲酰基犬尿氨酸转化的细胞内酶。通过 IDO-犬尿氨酸途径耗竭的色氨酸通过抑制 T 细胞增殖和促进 Treg 分化来调节免疫反应。
在牙周组织中，PDL 细胞在牙齿移动过程中受到间质液流体剪切应力的影响。剪切应力已被证明在多种细胞类型的细胞行为中发挥重要作用，包括胚胎干细胞、骨细胞、内皮细胞、MSCs 以及 PDL 细胞。以前，体外剪切应力刺激（3-15 dyn/cm2）被证明可以调节 PDL 细胞特性，例如成骨分化、细胞增殖和 ECM 重塑。此外，剪切应力有可能通过 COX2/PGE2 表达增强 MSCs 的免疫抑制作用。
然而，尚未阐明剪切应力对触发 hPDLSCs 免疫调节特性的影响。基于此，泰国朱拉隆功大学牙科学院解剖学系的课题组评估了剪切应力对 hPDLSCs 免疫抑制特性的影响，研究了剪切应力激活的免疫抑制分子对CD4+ T 细胞增殖和 Treg 分化的影响。研究表明，使用 hPDLSCs 的机械刺激作为一种有前途的方法来诱导免疫抑制，同时用同种异体疗法靶向组织再生。
剪切应力增强免疫抑制调节剂的表达
实验首先使用 CCK-8 测定法确定剪切应力对 hPDLSC 活力的影响。结果发现，所有大小的剪切应力（0.5-10 dyn/cm2）对细胞活力没有显著影响，这由 hPDLSCs 的线粒体活性表明。
为了确定剪切应力是否刺激 hPDLSCs 中免疫调节调节剂的表达，细胞受到 0.5、5、10 dyn/cm2 的剪切应力刺激 3h 后连续培养至 24h。收集细胞用于 mRNA 表达分析，包括 IDO、TGF-β1、COX2 和 IFN-γ。结果表明，5 dyn/cm2 处的应力显著增加 hPDLSCs 中 IDO（图1 A）和 COX2（图1 D）的基因表达，而 IFN-γ（图1 C）和 TGF-β1（图1 B）的表达没有显著差异。
图1 剪切应力诱导的 hPDLSCs 中免疫抑制调节因子的 mRNA 表达。剪切应力刺激后，采用 qRT-PCR 检测 IDO（A ）、TGF-β1（B）、IFN-γ（C）和 COX2（D）的 mRNA 相对表达量。
实验进一步研究了在剪切应力刺激后所有条件培养基中的 IDO 和犬尿氨酸（kynurenine）产物的活性（图 2 A、B）。与非剪切应力衍生的条件培养基（CTL-CM）相比，剪切应力衍生条件培养基（SS-CM）中 IDO 活性在 5、10 dyn/cm2 下增加（图2 A）。随后，5 dyn/cm2 时，SS-CM 中犬尿氨酸的产物量显著高于 CTL-CM（图2 B）。
关于 TGF-β1，实验在条件培养基中测定 TGF- β1 活性。虽然 5 dyn/cm2 剪切应力下，总 TGF-β1的分泌增加，但与 CTL-CM 相比，在所有剪切应力强度（0.5、5 和 10 dyn/cm2）下，SS-CM 中 TGF-β1 活性均增加（图2 C）。相比之下，与对照相比，剪切应力在 5 dyn/cm2 时降低了细胞裂解液中 TGF-β1 的活性形式，但对TGF-β1 的潜伏形式没有影响（图2 D-F）。
使用 ELISA 测定法测量细胞裂解物和条件培养基中 IFN-γ 的浓度。该测定显示，与对照相比，在所有剪切应力强度下，细胞结合的 IFN-γ 数量均无差异（图2 G）。相反，在 0.5 和1 0 dyn/cm2 下 IFN-γ 的分泌量降低（图2 H）。
至于 COX2 表达，分析了不同剪切应力强度下 hPDLSCs 中 COX2 依赖性 PGE2 的合成。结果显示，与 CTL-CM 相比，所有 SS-CM 组的 PGE2 产物没有差异（图2 I）。
这些表明，5 dyn/cm2 的剪切应力可以*佳地增强 IDO、犬尿氨酸和 TGF-β1 基因/蛋白的表达。
图2 剪切应力诱导 hPDLSCs 中免疫抑制调节因子的蛋白质表达。剪切应力促进了 hPDLSCs 中 IDO 活性（A）和犬尿氨酸产物（B）。剪切应力增加了 PDLSCs 衍生的条件培养基中活性 TGF-β1 的分泌（C）。蛋白质印迹分析hPDLSCs 中 TGF-β1 蛋白表达（D）。蛋白质印迹定量分析潜伏性 TGF-β1（E）和活性 TGF-β1的条带强度（F）。ELISA 测定法测定细胞裂解液（G）和条件培养基（H ）中 IFN-γ 的含量和不依赖 COX2 的 PGE2 的量（I）。
剪切应力通过 ERK1/2 信号通路增强 IDO 活性的产物
为了研究剪切应力增强 IDO 表达的调节机制和 hPDLSC 衍生条件培养基中犬尿氨酸的量，在剪切应力刺激（5 dyn/cm2）前用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（CHX）预处理细胞 1h。与对照相比，CHX 减弱了 IDO 的表达和犬尿氨酸的量（图3 A、B）。该结果表明，有中间分子参与了 hPDLSCs 中剪切应力诱导的 IDO 基因表达的调节机制。
细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的作用被证明与人类树突状细胞的免疫抑制特性的激活有关。因此接下来研究了剪切应力是否通过激活 ERK1/2 调节 IDO-犬尿氨酸和 TGF-β1 的分泌。hPDLSCs 用 ERK 抑制剂预处理 1h，随后置于 5 dyn/cm2 的剪切应力下 3h。在对照条件下，细胞在没有用 ERK 抑制剂预处理的情况下接受 3h 的剪切应力。蛋白质印迹检测剪切应力对 ERK1/2 和磷酸化 ERK1/2（P-ERK1/2）蛋白表达的影响。剪切应力诱导 hPDLSCs 的 ERK1/2 磷酸化，这种磷酸化被 ERK 抑制剂消除（图3 C-E）。在 ERK 抑制剂存在的情况下，剪切应力对 hPDLSCs 中犬尿氨酸含量的影响也减弱了（图3 F），但 TGF-β1 及其活性形式没有减弱（图3 G）。因此，剪切应力通过激活 ERK1/2 信号通路增强 hPDLSCs 中犬尿氨酸的分泌。
图3 剪切应力通过 ERK1/2 信号通路增强 hPDLSCs 中的 IDO 表达和 IDO 分解代谢的犬尿氨酸产物。剪切应力刺激后（5 dyn/cm2），CHX 处理的 hPDLSCs 中检查 IDO mRNA 表达和犬尿氨酸产物（A、B）。通过蛋白质印迹分析检查 ERK1/2 的活性（C）。Western blot 条带强度的定量分析表明，ERK 抑制剂减弱了剪切应力诱导的 hPDLSCs 中 P-ERK1/2（D）的表达，但不减弱 ERK1/2 的表达（E）。添加 ERK 抑制剂可抑制剪切应力诱导的犬尿氨酸分泌（F）。然而，剪切应力不影响 TGF-β1 分泌（G）。
剪切应力衍生条件培养基（SS-CM）抑制 T 细胞增殖
接下来评价了 SS-CM 对 PBMCs 中 CD4+ T 细胞增殖的抑制作用，CTL-CM 用作对照。T 细胞活化后，活化的 T 细胞显著形成簇状，细胞体积增加，数量增加。与没有条件培养基处理的活化 T 细胞相比，用 CTL-CM 和 SS-CM 处理后 T 细胞增殖显著降低。此外，SS-CM 中 T 细胞的增殖明显低于 CTL-CM（图4 A）。这表明，源自 hPDLSCs 的条件培养基抑制了 T 细胞的增殖，并且这种效应可以通过剪切应力刺激来增强。
图4 剪切应力减弱 CD4+ T细胞增殖并促进 Treg 分化。所有 hPDLSC 衍生的条件培养基均与 CD4+ T细胞间接共培养。CD4+ T 细胞的增殖使用 resazurin 测定法评估。SS-CM 降低了 T 细胞增殖的百分比（A）。在 SS-CM 处理的 CD4+ T细胞中，FOXP3（B）和 IL-10（C）的 mRNA 表达上调。流式细胞仪分析显示 与 CTL-CM 和激活的 T 细胞相比，SS-CM 中 CD4+CD25hi CD127lo/− Treg 细胞数量百分比增加（D、E）。
剪切应力衍生条件培养基（SS-CM）诱导的调节性 T 细胞分化
为了进一步研究 SS-CM 是否诱导调节性T（Treg）细胞的发育，将活化的 T 细胞与 SS-CM 共培养 5 天。Treg 细胞的特征在于 Treg 特异性基因标志物 FOXP3 和 IL-10。结果表明，与活化的 T 细胞和 CTL-CM 相比，SS-CM中 FOXP3 的 mRNA 表达显著增加（图4 B）。与活化的 T 细胞相比，CTL-CM 和 SS-CM 中 IL-10 的表达上调。然而，IL-10 的 mRNA 表达在 CTL-CM 和 SS-CM 之间没有差异（图4 C）。先前的一项研究表明，CD4+CD25hi CD127lo/− 是功能性 Treg 群体的有效纯度标记。该研究表明，与激活的 T 细胞和 CTL-CM 相比，SS-CM 增加了CD4+CD25hi CD127lo/− Treg 细胞的比例（图4 D、E）。因此，这些结果表明，源自剪切应力诱导的 hPDLSCs 的条件培养基可增强 Treg 特异性标志物（FOXP3 和 IL-10）的 mRNA 表达并增加 Treg 细胞群数量。
图5 剪切应力通过 ERK 诱导的 IDO 和TGF-β1活性激活 hPDLSCs 的免疫抑制能力示意图。剪切应力通过 ERK1/2 激活增强 hPDLSCs 中 IDO 依赖性犬尿氨酸，并增加细胞外基质或条件培养基中 TGF-β1 总量和活性。犬尿氨酸和 TGF-β1 分泌增加抑制 CD4+ T 细胞增殖和促进 Treg 细胞分化。
总之，该研究结果表明，剪切应力通过 ERK1/2 信号通路增强 hPDLSCs 中的犬尿氨酸。响应剪切应力，hPDLSCs 分泌活性 TGF-β1 和犬尿氨酸，从而抑制 T 细胞增殖并促进 Treg 分化（图5）。研究结果有助于更好地理解 hPDLSCs 对机械刺激（例如牙齿运动过程中产生的机械刺激）的免疫抑制特性。可以相信，hPDLSCs 的旁分泌介导的免疫调节功能可能是一种有前途的临床应用方法，特别是在同种异体细胞治疗的情况下。
参考文献：Suwittayarak R, Klincumhom N, Ngaokrajang U, Namangkalakul W, Ferreira JN, Pavasant P, Osathanon T. Shear Stress Enhances the Paracrine-Mediated Immunoregulatory Function of Human Periodontal Ligament Stem Cells via the ERK Signalling Pathway. Int J Mol Sci. 2022 Jun 27;23(13):7119. doi: 10.3390/ijms23137119. PMID: 35806124; PMCID: PMC9266779.
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