牙源性角化囊肿（OKC）是一种局部侵袭性颌部囊性病变，其特点是具有相对较高的生长潜力和复发倾向。OKC 的异常行为，沿着颌骨的长轴生长和相对较高的复发率，表明其局部侵袭性背后的异常分子事件。血管生成和细胞侵袭是复杂的多阶段过程，始于由蛋白水解酶引起的细胞外基质降解，尤其是肿瘤相关基质金属蛋白酶。
趋化因子是白细胞迁移到炎症部位的重要递质，在炎症中起重要作用。在 OKCs 中经常检测到炎症。先前的研究表明，在 OKC 中，在中度至重度炎症附近检测到增殖性上皮细胞的局灶性增加，但对囊肿的整体增殖活性没有显著影响。因此，炎症可能与上皮的局灶性增殖密切相关。
机械应力对肌肉骨骼健康和疾病至关重要。除遗传因素外，牙源性囊性病变长期存在囊内流体压力，影响牙源性囊性病变的发展。机械应力现在也可能成为某些形式的慢性炎症性病变的触发因素，例如牙周炎和类风湿性关节炎。然而，OKC内机械应力和趋化因子释放之间的潜在关系仍不清楚。
单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）代表了一种发现健康和疾病中转录异质性的创新方法，揭示了对组织组成和疾病进展的新见解，实际上，迫切需要发现有助于 OKC 发病机制的细胞群。
在口腔生物医学教育部重点实验室（武汉大学）以及武汉大学口腔医院口腔颌面外科、口腔修复科实验团队的一项研究中，使用新鲜的 OKC 组织样本进行单细胞 RNA 测序，旨在定义OKC 的细胞亚群，特别是与血管生成相关的细胞亚群，并探索血管生成的潜在调节机制。结果表明，CXCLs 在成纤维细胞亚群中高度表达，并与受机械应力部分调节的内皮细胞和骨髓细胞密切相互作用。该研究探讨了 OKC 的病理机制，并提供了新的见解。
实验首先进行单细胞测序和细胞类型鉴定。新鲜的 OKC 组织样本分为两部分：一份用于苏木精伊红染色，另一份用于 scRNA-seq。对于 scRNA-seq，消化新鲜组织直至获得含有 1.5×105、1.0×105 和 1.3×105 细胞的单细胞悬液，细胞活力分别为 81.60%、83.50% 和 84.3% 。质控后得到 14,072 个单细胞，聚类成 8 个细胞群，其中，KRT5+ 基底细胞再次细分成 5 个亚群，成纤维细胞（LUM+）分为 3 个亚群。结果发现，OKC 的细胞成分在供体之间表现出高度的异质性。
牙源性角化囊组织样本中的成纤维细胞异质性
成纤维细胞（LUM+）聚为三个亚群。SFRP4 和 SPP1 在 fibroblast #1 中高表达（图1 A）；Fibroblast #3 高表达许多趋化因子的基因，包括 CXCL1、CXCL13、CXCL12、CXCL6 和 CXCL8（图1 A）；Fibroblast #2 高表达细胞增殖基因，包括 H2AFZ、TOP2A 和 MKI67。分化轨迹显示，fibroblast #3 分布在发育的初期（图2 B）。
根据分布发现，成纤维细胞亚群在病例中有所不同，但 fibroblast #3 占 50% 以上，是常见的类型（图1 C）。
对 fibroblast #3 的 DEGs 进行 GO 分析，以研究每个亚组的功能。Fibroblast #1 与细胞外基质成分和糖胺聚糖结合有关（图1 D）。Fibroblast #2 与微管蛋白结合和微管结合有关（图1 E）。 Fibroblast #3 在细胞因子活性和趋化因子活性方面表现出富集基因（图1 F）。这些结果表明， fibroblast #3 是 OKC 成纤维细胞常见的细胞类型，并且富含趋化因子和细胞因子基因。
图1 在牙源性角化囊肿（OKC）中鉴定出三种不同的成纤维细胞亚型。（A）从 fibroblasts #1 到fibroblasts #3 的差异基因表达组。（B）3 个OKC 样本中从fibroblasts #1 分化为fibroblasts #3 的轨迹分析。（C）3 例 OKC 患者中主要成纤维细胞簇的比例。（D-F）对fibroblasts #1到fibroblasts #3中上调基因进行 GO 分析。
Fibroblast #3 中富含机械应力调节基因
为了进一步探索成纤维细胞亚群的潜在特征，研究了包括 TAGLN2 和整合素（ITGA8）在内的细胞骨架相关基因，它们在 fibroblast #3 中高表达，表明 fibroblast #3 中潜在的机械调节（图2 A）。
牙源性角化囊肿通常是半流体性病变，检查过囊内流体压力，初期约为 80 mmHg。为了模拟静水压力的潜在影响，实验采用压缩加载系统并对成纤维细胞施加 80 mmHg 压力持续 6 小时（图2 B）结果显示，与对照组相比，静水压力处理的成纤维细胞中 CXCL12 表达明显上调（图2 C）。但其他趋化因子（CCL21、CXCL5、CX3CL1、CXCL1、CXCL8、CCL2、CCL25）无显著变化（图2 C）。CXCL5 趋化因子在所有趋化因子中浓度最高（超过 2000 pg/mL）（图2 C）。
图2 机械应力调节成纤维细胞中 CXCL12 的分泌。（A）点图显示 TAGLN2 和 ITGA8 在 3 个成纤维细胞簇中的表达。红色虚线矩形表示 3 个成纤维细胞簇中的平均相对表达 > 0.5。（B）用于对OKC培养的成纤维细胞施加压力的静水压力装置示意图。（C）来自静水压力（80 mmHg, 6h）处理的 OKC 成纤维细胞上清液的趋化因子谱（CCL21、CXCL5、CX3CL1、CXCL1、CXCL8、CCL2、CXCL12 和 CCL25）。
Fibroblast #3 与 OKC 的血管生成密切相关
为了进一步评估 CXCLs 的受体，证明了非典型趋化因子受体1（ACKR1）在内皮细胞中富集（图3 A）。使用 CellphoneDB v2.0 研究了细胞-细胞相互作用网络。值得注意的是，fibroblast #3 与内皮细胞表现出特异性强相互作用（图3 B）。
为了进一步验证 CXCLs 的表达水平，构建了 OKC 的组织微阵列，免疫组化结果发现 CXCL12 主要在成纤维细胞和免疫细胞中表达（图3 C）。通过 CXCL12 和 CD31 的 H-score 统计分析，发现基质中 CXCL12 表达与 CD31 的表达密切相关（图3 D）。
这些结果表明，基质内 CXCL12 的表达可能与 OKC 的血管生成密切相关。
图3 趋化因子富集的成纤维细胞与内皮细胞密切相关。（A）小提琴图显示了主要细胞类型中ACKR1的表达。（B）显示 CellphoneDB v2.0 预测的细胞组中潜在配体-受体对数量的热图。（C）OKC组织微阵列中的 CXCL12 和 CD31 染色。（D）OKC 中基质 CXCL12 与CD31 染色密切相关。
总之，这项工作是第一项通过 scRNA-seq 在转录组水平上全面描述 OKC 细胞的研究。研究说明了一种成纤维细胞亚群（称为富含趋化因子的成纤维细胞）的作用，以及与血管生成和免疫浸润的密切关系，后者部分受静水压力的调节。研究结果揭示了对 OKC 细胞亚型以及物理微环境与 OKC 血管生成之间关系的新见解。因此，有助于理解 OKC 病变内的异质性，并为 OKC 提供新的发病机制。
参考文献：Man QW, Li RF, Li SR, Wang J, Bu LL, Zhao Y, Liu B. Single-Cell RNA Sequencing Reveals CXCLs Enriched Fibroblasts Within Odontogenic Keratocysts. J Inflamm Res. 2021 Dec 24;14:7359-7369. doi: 10.2147/JIR.S342951. PMID: 34992422; PMCID: PMC8713881.
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