| 产品及特点 | 本产品是根据本公司的双染料 RT-LAMP 技术开发的荧光和可见光双模式检 测试剂盒 ，它既可以用于荧光 RT-LAMP 扩增及检测 ，也可以用于可视化 RT-LAMP 扩增及检测 ，适用于各种针对核酸的快速定性检测。 本产品具有下列特点： 1. 含可见光和荧光染料， 既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果 ，也可 用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。 2. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。 3. 特异性比 RT-PCR 高， 因为 RT-LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。 4. 灵敏性可达 10 拷贝/反应以下 (随引物而不同) ，故假阴性率更低。 5. 只可用于科研 ，只可进行定性检测 ，不能用于定量检测。 | |||||||
| 规格及成分 | 成 份 | 编号 | 塑料盒包装 | |||||
| MMLV 逆转录酶(含 RI)， 200U/μL | 60905a | 50 μL (黄盖) | ||||||
| 4 ×RT Buffer (含 dNTP) | 60905b | 250 μL (白盖) | ||||||
| 5 ×荧光及可视化 LAMP MagicMix | 200603a | 200 μL (绿盖) | ||||||
| Bst DNA 聚合酶 2.0 ( 8U/uL) | 200403 | 50 uL (红盖) | ||||||
| RT-LAMP 阳性对照模板-引物混合物 | 130923a | 20 μL (黄盖) | ||||||
| 超纯水 | 100935 | 1mL (亮黄盖) | ||||||
| 使用手册 | 200603sc | 1 份 | ||||||
| 运输及保存 | 低温运输， -20 ℃保存，保存期限为一年。 | |||||||
| 自备试剂 | RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 级石蜡油 (仅对使用金属浴或水浴者) 。 | |||||||
| 使用方法 | 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴， 需要在实验启动前打开并调到 60-65℃。如果 用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。金属浴和水浴温控远 远不如 PCR 仪器， 所以使用前需要用阳性对照和阴性对照 (水) 做预实验确认可用。 一、 样品 RNA 的制备 1. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA 提取试剂盒兼容。 2. 如果有 N 个样品， 则至少需要做 N+2 个样品制备， 包括一个制备阳性对照(制备 时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板， 一起经历提取过程) 和一个 制备阴性对照 (用水替代样品)。最后 N+2 个样品一起进行 RNA 提取操作，得 到 N+2 个 RNA 样品。 二、 合成 1st-strand cDNA 3. 按下表配制 RT 反应体系: | |||||||
| 成分 | 加入量 | |||||||
| 自备 RNA 模板 总 RNA 或 poly(A) mRNA 或专一的 RNA 注意 ：RNA 样品不能有基因组 DNA 污染。 |
100-500 ng 10-500 ng 0.01pg-500ng | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 自备引物 F3 | 1 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 4 ×RT Buffer (含 dNTP) | 5 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 自备 RNase-free 水 | 补水到 19 μL | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 4. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。 5. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保温 5 分钟。 6. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶(含 RI) ，终体积为 20μL。 7. 42℃保温 60 分钟。 8. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 LAMP 模板使用，不需要纯化。 三、 荧光及可视化 LAMP 扩增及检测 ( 20μL 体系) 9. 反应设置：如果有 N+2 个 cDNA 样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 阴性对照和 LAMP 阳性对照各 1 个。在 N+4 个 0.2mL PCR 管中加入下列成分：
10. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料， 可以根据实验室条件选择下列三种方式进 行扩增和检测。 11. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反应管中 加 30 μL 自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率(如 果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油)。 60-65℃保温 90 分钟，肉 眼观察管内液体颜色。 12. 如果使用荧光定量 PCR 仪： 设为 60-65℃保温 1 分钟/循环， 90 个循环， 每分 | |||||||||||||||||||||||||||||||
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| 钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。 13. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法荧光读数： 则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数(温度设为 60-65 ℃， 1 次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。注意： 测荧光读数必 须在 65℃进行) 。扩增反应按 60-65 ℃ ，90 分钟进行。 四、 结果分析及解读 14. 如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结 果。将反应管放置在白色背景(如白纸) 前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现 蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反应液不呈 现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说明试剂有问题， 实 验无效。请跟厂家联系。 15. 如果实验有效， 则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增 阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照， 则说明无扩增。 反应结果示例见左图(9 为阴性， 10 为阳性) 。 16. 如果是用荧光 PCR 仪进行扩增， 则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照 的 Ct 将小于 60，如果大于 60，说明试剂可能失效， 需跟厂家联系。无模板阴性 对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被 污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则 分析样品的 Ct。Ct 小于 60 的判断为阳性，大于 90 判为阴性， 在 60-90 之间则 需要重复检测。 17. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量 PCR 仪 进行终点法荧光读数来判断阴阳性， 则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品 扩增后信号增幅应该超过 100%， 阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则 实验无效， 请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的 差值。如果扩增后荧光信号增幅低于 50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高 于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50- 100%之间的， 则需要重测。 18. 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致， 以实时荧光 LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果 20-30 分钟，也就是 说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品， 其反应液的颜色变化一般在第 50-60 分钟时才能观察到。 |
| 关联产品 | 免核酸纯化病毒保存液， PCR 级石蜡油 |
