植物RNA提取试剂盒的操作步骤与应用！

植物RNA提取试剂盒的操作步骤与应用！

一、背景

植物RNA提取试剂盒用于从各种植物中提取纯化高品质总RNA，也适用于真菌菌丝RNA的提取。的Shredder分离柱，用于匀质化和过滤高粘度的植物或真菌裂解物，同时采用硅基质膜吸附RNA进行纯化，使多聚糖等各种污染物通过洗涤被有效去除，经洗脱的RNA可直接用于各种下游实验。由本试剂盒提取RNA分子量大于200碱基，纯度高，几乎无DNA残留。如果是对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot、RT-PCR和体外翻译等实验。

二、操作步骤

1、50-100 mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)或Buffer RLC。涡旋振荡使其充分裂解。

2、将步骤1所得全部液体转移至已装入收集管的过滤柱中，12000rpm(~～13400×g)离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管(自备)中。

3、在步骤2所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。

注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。

4、将上步得到的溶液转移到已装入收集管的吸附柱中,若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入;12000rpm离心15秒，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。

7、向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。

8、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇),12000rpm离心15秒,弃废液。

10、重复步骤9。

11、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心1分钟，将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干吸附柱中的无水乙醇。

12、将吸附柱装入新的离心管中，向吸附膜的中间加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

三、应用

用于马铃薯病毒快速检测技术的建立与应用研究：

马铃薯病毒病是重要的马铃薯病害，每年均造成严重的经济损失。目前，生产和利用脱毒种薯是防治马铃薯病毒病的重要方法，快速、准确的马铃薯病毒检测技术是保证脱毒种薯质量的关键。

研究依据马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）基因序列设计合成了4对具毒特异性的引物。利用病毒特异性引物，以带有不同病毒的马铃薯样本总RNA为模板分别进行RT-PCR扩增，获得了4条DNA片段，将4条DNA片段与克隆载体连接后转入大肠杆菌进行序列测定，对测序结果进行分析证明PCR扩增所得DNA片段确为目标病毒相应的目的基因片段（核苷酸同源性达到99%以上）。

利用4对病毒特异性引物建立了4种病毒的常规RT-PCR检测技术。对马铃薯病毒RT-PCR检测技术中RNA的提取方法进行了改进，以解决由于马铃薯块茎淀粉含量过高而导致利用常规的植物RNA提取试剂盒无法提出块茎RNA的问题。首先研究开发出一套新的马铃薯块茎总RNA提取方法，利用此方法制备的RNA*符合后续进行马铃薯病毒RT-PCR检测的要求，而该方法更为快速、简便，且成本低廉，适用于大量样品的提取检测。

在此基础上，又研制开发了一种新型缓冲溶液，在进行病毒检测时，将马铃薯块茎组织在此缓冲溶液中研磨匀浆后，即可直接进行RT-PCR检测，不需进行马铃薯块茎RNA的提取，因此，该方法操作更加简便，检测效率更高，成本更低。该方法在国内尚未见报道。

对马铃薯病毒RT-PCR检测技术的反应体系及反应程序进行了改进。利用PVS、PVY、PVA的特异性引物建立了可对3种病毒进行同步检测的三重RT-PCR检测技术，并对PCR反应中的MgCl2的浓度进行优化，结果表明，当MgCl2浓度为5.5mmol/L时，PCR检测。

此方法更为快速、简便、高效。采用所建立的病毒检测技术对河南省和黑龙江省部分脱毒试管苗和脱毒种薯进行了检测，结果表明，河南省的样本中检出率的为PVY，其次是PVA；黑龙江省的样本中检出率的是PVS、其次是PLRV。采用所建立的病毒检测技术对我国部分马铃薯产区中马铃薯病毒病发生情况进行了调查。