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超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒的应用！

一、背景

超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒可在30分钟之内，快速、有效地从土壤以及其他环境样品中提取基因组DNA。适用于从土壤中的所有生物包括G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫类甚至真细菌的孢子、芽孢中提取基因组DNA。而且它还可以提取其他环境样品的DNA，如沉积物、排泄物、废水、雪水等。只需500mg的样品即可得到足够的DNA。实验原理为用特殊的裂解介质E处理样品，之后使用自旋过滤器基于硅吸附DNA原理的GENECLEAN®步骤进行纯化，得到的DNA可用于PCR、限制性酶切、电泳及其他下游实验。

二、操作步骤

1、称取0.3 g~0.4 g样品加入Lysing Matrix E Tube中。（注意：需保证加完样品及所需溶液后，管中应留出不少于200μL空间）

2、加入978μL SPB，加入122μL MT Buffer。

3、盖紧Lysing Matrix E Tube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40 s~50 s。（注意：时间不可过长，有可能打断基因组DNA片段降低提取质量）从各个角度都可以震荡一下，不要光是底部。

4、在8000 r/min转速下离心15 min，有利于去除体积较大或具有复杂细胞壁结构的样品碎屑。

5、将上清液用大口枪头吸出转入1.5 mL的微离心管中，加入250μL PPS，手持离心管晃动10次以混匀。

6、在8000 r/min下离心5 min，用大口枪头将上清液转移至5 mL离心管中。

7、摇匀Binding Matrix后，吸取1.0 mL加入上一步离心管中。

8、将离心管上下颠倒2 min后，静置3 min，使DNA附着于Bingding Matrix上，并等待二氧化硅基质沉淀。（这一步根据沉淀情况时间可以适当延长）

10、将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μL混合液移入SPIN Filter中，8000 r/min下离心1 min。

11、倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至5 mL离心管中的液体吸尽。

12、加入已制备好的SEWS-M溶液500μL，用小枪头小心混匀后，8000 r/min下离心1 min后，弃去收集管中的液体。

13、为更好的去除杂离子，重复第12步，更换为1.5 mL离心管。

14、在8000 r/min下离心2 min，去除残留的SEWS-M溶液，然后更换为干净的1.5 mL离心管。（若发现残余溶液较多，可重复此步骤）

15、在室温下，将SPIN Filter风干5 min。（时间可以更久一些）

16、往SPIN Filter加入80μL DES溶液，用小枪头小心使之与Binding Matrix混匀，65℃水浴15 min（有利于DNA的溶出）。8000 r/min下离心2 min，可得到约50μL的DNA溶液。再加入80μL DES溶液重复第16步操作，一共可得到约100μL的DNA溶液。

17、弃去SPIN Filter，将提取好的DNA存于-20℃冰箱保存。

三、应用

用于土壤中多功能木霉菌的筛选鉴定及木霉多样性分析研究：

实验从四个地区的西红柿、黄瓜大棚,韭菜、白菜菜地,大蒜、大葱种植区采取的120份土壤样品中分离获得木霉244株。通过对峙培养实验发现对棉花棉花立枯丝核菌具有一定拮抗功能的有114株,其中拮抗作用较好的有19株;通过固体培养法检测解磷、解钾、固氮能力发现,244株木霉中有74株具有明显解磷圈,且发现拮抗效果较好的19株解磷圈较大,未发现有明显解钾透明圈的菌株,所有菌株在固氮培养基上无生长现象。

对19株拮抗效果较好且解磷圈较大的菌株进行液体培养检测解磷、解钾能力,发现,在液体培养条件下,部分菌株未显示出解磷能力,菌株T13-8（1.792μg/mL）、T23（1.652μg/mL）显示出较高的解磷能力;部分菌株在液体培养下显示出一定的解钾功能,菌株T47-4（20.585μg/mL）显示出较高的解钾能力。

通过平板实验检测此19个菌株植酸酶活性发现,能够水解植酸钙的有15株,其中包括高效解磷菌株T13-8、T23,高效解钾菌株T47-4。对以上19个菌株进行了形态学和分子生物学鉴定,发现菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1为Trichoderma longibrachiatum;菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17为Trichodermaharzianum;菌株T61-2为Trichoderma virens;菌株T18-1为Trichodermacitrinoviride。依据ITS序列进行的系统发育分析结果支持此19个木霉菌株的鉴定结果。

研究土壤木霉多样性时,将来自相同地区同种蔬菜作物的土样混合为一份土样,120份共混成13份混合土壤样品,设计木霉ITS区特异保守序列扩增引物,利用PCR-DGGE技术对土壤木霉的多样性进行了分析。

发现同一地区,不同蔬菜作物土壤中,木霉种类具有相似性,不同地区之间也有相似种;木霉多样性高的地区土传病害的发生相对较少。为了进一步对PCR-DGGE技术用于土壤木霉多样性分析的可行性提供理论支持,本实验先后通过DGGE技术对19株木霉混合基因组DNA和对应土样基因组DNA的PCR产物、4株单个木霉基因组DNA和相应土样基因组DNA的PCR产物进行了分析,两项研究都证明了DGGE技术应用于土壤木霉多样性分析结果的可靠性。