具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）基序的转录因子（TF）通过激活或抑制不同靶基因的表达，在神经祖细胞（NPC）向神经元和少突胶质细胞的命运决定中发挥重要作用。神经元PAS结构域蛋白3（NPAS3）属于TFs的bHLH PAS超家族，研究表明，携带bHLH结构域缺失的NPAS3缺陷小鼠显示成年海马神经发生和认知行为缺陷。星形胶质细胞功能障碍通过影响邻近神经元功能而诱发多种神经系统疾病。然而，在皮质发育过程中星形胶质细胞以及星形胶质细胞-神经元通信如何调节复杂行为仍然未知，且调节NPC向星形胶质细胞分化的bHLH因子也未被研究。
2022年，8月30日，中科院北京生命科学学院孙中生与王彦课题组在cell reports上发文揭示bHLH因子（NPAS3）缺陷将损害皮质星形细胞生成并诱导自闭症样行为。
首先，课题组通过免疫染色发现Npas3缺陷导致小鼠发育过程中皮质星形胶质细胞生成减少。而对成年鼠的大脑评估显示：Npas3+/-鼠的大脑重量和宽度及皮质长度显著增加，表现出大头畸形。结构性磁共振结果显示Npas3+/-鼠的脑脊液、扣带皮层、胼胝体和蓝斑区域体积显著增加；此外，体素分析结果显示其脑脊液体积增加，而由星形胶质细胞驱动的白质体积减少。
图1|Npas3+/-鼠脑部结构异常
随后，课题组对两组小鼠进行行为学测试，结果显示：Npas3+/-鼠在社交测试阶段对物体和陌生鼠的探索时间没有差异，在社交新颖性测试阶段对陌生鼠和熟悉鼠的探索时间没有差异，即表现出社交及社交新颖性缺陷；而在超声波发声实验中，Npas3+/-幼崽在P7（出生后7天）和P13与母鼠分离时发出的呼叫较少，呼叫持续时间较短；此外，Npas3+/-的自我梳理时间也显著增加，表现出焦虑样表型。这些结果表明Npas3缺陷导致小鼠产生ASD样行为。
图2|小鼠行为学测试结果
为了确定NPAS3在星形胶质细胞发生初期诱导的转录变化，课题组在P0期对WT和NPAS3+/-小鼠皮层进行了RNA测序，并发现与胶质细胞生成和突触调控有关的基因表达水平下调；高尔基染色结果显示Npas3+/-皮质II/III层锥体神经元基底树突棘密度显著降低，而透射电镜的结果显示Npas3+/-小鼠皮层中突触后致密区PSD）的不对称突触的数量显着减少，其PSD长度也显着减少。体外培养实验显示：NPAS3缺陷的星形胶质细胞将减少与之共培养的神经元数量。这些结果表明星形胶质细胞的异常发生影响了星形胶质细胞-突触的相互作用。
图3| 体外共培养实验结果
进一步的单细胞转录组数据分析显示，Npas3缺陷将扰乱小鼠脑中放射状胶质细胞到星形胶质细胞的正常分化，从而显著降低星形胶质细胞的生成。ChIP测序数据的分析表明NPAS3 的结合靶点广泛覆盖了星形胶质细胞形成的各个过程，并涉及大脑发育、树突发育和突触形成的调节网络。最后，课题组采用化学遗传的方法在WT鼠的星形胶质细胞中特异性敲低NPAS3，发现这些小鼠同样表现出自闭症样相关的形态和行为异常。
图4|NPAS3影响树突发育和星形胶质细胞对突触形成的控制
总的来说，该文发现bHLH转录因子——NPAS3调节星形胶质细胞分化以及星形胶质细胞-神经元通讯过程，且NPAS3缺陷会导致星形胶质细胞生成异常并引发自闭症样行为。这项研究为bHLH转录因子在星形胶质细胞生成中的缺陷如何影响皮质发育和复杂行为的机制提供了见解。
