铜死亡——细胞死亡研究新方向

2012年铁死亡被发现后，它的相关研究经历了指数级的增长，也是近几年热门中的 “热门”。小优曾用3篇文章详细的剖析过它，从研究历程到正式命名，再到通路研究，都有详细解读，不清楚的同学可以戳链接再了解。

在今年的3月17日，美国Broad研究所Todd R. Golub研究组与Peter Tsvetkov合作在Science上发表了题为“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins” 的研究文章。文章一经发布，“铜死亡”一词迅速霸屏。可以预见，未来几年，铜死亡的相关研究，也会迎来“井喷式”爆发。

为了方便各位快速了解铜死亡，大家拿好小板凳做好，小优课堂马上就要开课了。

本文核心观点：
1. 揭示了一种新的细胞死亡机制——铜死亡，证明铜诱导的细胞死亡是由蛋白质脂酰化所介导的 
2. 铜死亡是通过铜与TCA循环的脂酰化成分直接结合而发生的，这导致脂酰化蛋白质聚集，以及铁硫簇蛋白质丢失，从而导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡
3. FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子，FDX1和蛋白质脂酰化是铜死亡的关键调节因子

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铜是所有生物体不可少的辅助因子，通过跨浓度梯度起作用的主动稳态机制可以将细胞内铜浓度保持在非常低的水平，以防止对细胞有害的游离铜的累积。不过铜稳态的遗传变异会导致致命的疾病，并且铜离子载体和铜螯合剂都被认为是抗癌剂。然而，过量的铜如何诱导细胞死亡尚不清楚。

铜离子载体是与铜结合的小分子，可以将铜运送到细胞内，因此是研究铜毒性的有用工具。多条证据表明，铜离子载体诱导细胞死亡的机制涉及细胞内铜的积累，而不是小分子伴侣本身的作用。

一、铜离子载体诱导一种特别形式的受调节的细胞死亡

为了确定铜离子载体的细胞毒性是否依赖于铜本身，研究人员首先利用Elesclomol这种铜离子载体验证了仅有铜离子能够介导细胞的死亡，而搭载其他金属离子时不具备对细胞杀伤的活性。接下来验证了铜离子介导细胞死亡的机制，通过凋亡的标志物检测，以及凋亡或铁死亡的抑制剂均不能抑制铜离子所介导的细胞死亡，这表明铜离子载体诱导的细胞死亡很可能是一种新的细胞死亡途径，明显区别于传统的凋亡、铁死亡和坏死等细胞死亡方式。

图1：铜离子载体诱导的细胞死亡与传统死亡途径不同

A：在489个细胞系中测试了1448个载铜药物对细胞的杀伤效果，结果表明这些载铜药物均能杀伤细胞
B：单独加入Elesclomol不影响细胞的生长，而一旦加入铜离子，细胞生长受到极大抑制。相反，加入其他金属，例如铁钴锌镍等也不影响细胞生长
C：用浓度低至40nM的铜离子载体Elesclomol脉冲处理，2ｈ细胞内铜水平增加15至60倍，超过24小时后引发细胞死亡。该结果表明铜介导的细胞死亡确实受到调节
D、E：Elesclomol诱导的细胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激活
F、G：当细胞凋亡的关键效应子BAX和BAK1被敲除或当细胞与泛半胱天冬酶抑制剂共处理时，Elesclomol仍能诱导细胞死亡，再次表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同
G、H：铜诱导的细胞死亡与已知细胞死亡机制不同

二、线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡

研究人员观察到更依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子的敏感性比进行糖酵解的细胞高近1000倍。如果采用药物干预线粒体功能后，细胞对铜离子的敏感性发生显著变化。通过乏氧条件培养细胞，研究人员进一步证实了铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸参与，而糖酵解产生的ATP方式，对铜诱导的细胞死亡影响较小。进一步研究发现，用铜离子载体处理不会显著降低基础呼吸或ATP相关呼吸，但会显著降低呼吸的储备能力，这表明铜不直接靶向ETC，而是靶向TCA循环的组成部分。

图2：线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡

A：更依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子的敏感性比进行糖酵解的细胞高近1000倍
B：用线粒体抗氧化剂等处理，对铜离子载体的敏感性具有非常明显的影响。ETC的复合体I/II的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取的抑制剂能减少细胞死亡，但对铁死亡没有影响
C：线粒体解偶联剂FCCP对铜毒性没有影响，这表明铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸
D：低氧条件下，铜诱导的细胞死亡减弱，进一步强调了细胞呼吸在介导铜诱导的细胞死亡中的作用
E：铜不直接靶向ETC而是靶向TCA循环的组成部分
F：铜离子载体诱导的细胞死亡和线粒体代谢之间的联系

三、FDX1和蛋白硫辛酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子

为进一步研究铜离子和 TCA 循环之间的联系，研究人员使用 CRISPR-Cas9 技术，分别敲除不同的基因，再使用铜离子载体处理细胞，以确定涉及参与铜离子载体诱导细胞死亡的基因。结果发现有7个基因的敲除可以明显缓解铜离子载体介导的细胞杀伤作用，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途径的三个关键酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脱氢酶复合体的三个组分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明显减轻铜离子载体引起的细胞毒性，这进一步加强了FDX1和铜诱导的细胞死亡之间的功能联系，也因此，研究人员猜测 FDX1 有可能是蛋白质硫辛酰化修饰的上游调节因子。

图3：FDX1 和蛋白硫辛酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子

A-C：敲除了不同基因后，细胞参与铜离子载体诱导的死亡的基因（蓝色）
D：硫辛酸通路的示意图
E：代谢酶筛选显示，复合物I的基因抑制也使细胞免于铜诱导的死亡
F、G： FDX1和LIAS的缺失赋予了对铜诱导的细胞死亡的抵抗力

四、FDX1 是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子

为了验证上述猜测，研究人员首先通过检索公共数据库，发现FDX1和硫辛酸代谢相关蛋白在铜离子载体诱导细胞死亡方面是高度相关的。其次，对208例人类肿瘤样本进行了FDX1和硫辛酰化蛋白的免疫组织化学染色，发现FDX1和硫辛酰化蛋白的表达高度相关。之后，通过免疫印迹和免疫组织化学检测，发现敲除FDX1会导致DLAT 和 DLST 蛋白的硫辛酰化*丧失，同时也导致细胞呼吸水平显著下降。这些结果均表明FDX1是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子。

图4：FDX1 是蛋白质硫辛酰化的上游调节因子

A：FDX1 敲除的相关基因网络
B-C：肿瘤样本的 FDX1 和硫辛酰化蛋白的免疫组化染色
D：敲除 FDX1，检测硫辛酰化蛋白的表达量
E：敲除 FDX1 ，检测细胞耗氧率
F：敲除 FDX1，检测与硫辛酰化途径相关的代谢物的变化

五、铜直接结合并诱导硫辛酰化 DLAT 的寡聚化

上述实验已经建立了铜毒性和蛋白质硫辛酰化之间的联系，但没有确定直接的机制。有研究报道铜离子与游离脂酸的解离常数为 10–17，这表明铜离子有可能直接与硫辛酰化蛋白结合。

为了验证这一猜想，研究人员纯化了DLAT和DLST蛋白，发现二者都可以与偶联铜的树脂结合。而敲除FDX1会导致DLAT蛋白的硫辛酰化修饰消失，且 DLAT和DLST也不再与偶联铜的树脂结合。这表明蛋白质的硫辛酰化修饰是结合铜的必要条件。此外，铜与硫辛酰化蛋白 DLAT 的结合，会导致蛋白的寡聚化，而 Elesclomol 处理会增加 DLAT 蛋白的寡聚化。

图5：铜直接结合并诱导硫辛酰化 DLAT 的寡聚化

A：细胞提取蛋白和偶联铜的树脂的结合
B-E：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化
F-H：强还原剂TCEP处理，表明寡聚体是二硫键依赖性的

六、铜诱导细胞死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同

为了探讨与铜离子载体治疗相关的铜毒性机制是否与这些自然发生的铜稳态失调有关，研究人员检查了三个实验模型。首先，在HEK 293T和ABC1细胞中过表达SLC31A1，这显着增加了对生理铜浓度的敏感性。另外，过表达 SLC31A1 的细胞被铜离子载体处理后，蛋白硫辛酰化减少，Fe-S簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高。

在过表达SLC31A1的细胞中，铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能阻止铜诱导的细胞死亡，而铜螯合剂、FDX1敲除和LIAS敲除各自部分却可缓解铜离子载体产生的细胞杀伤作用。

最后，使用老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b−/−，铜失调综合征 Wilson’s disease 模型) 与杂合子 (Atpb7b+/−) 和野生型对照小鼠对比，发现 ATP7B 缺陷小鼠的肝脏中蛋白的硫辛酰化水平和 Fe-S 簇蛋白的含量均有显著降低，Hsp70 蛋白则有明显增加。多种模型证明铜稳态失调导致的细胞死亡和铜离子载体诱导的细胞死亡是同一种机制。

图6：铜诱导细胞死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同

E、F：过表达SLC31A1，CuCl2 处理细胞
G、H：用 Nec-1 等处理过表达 SLC31A1 的细胞，加入 CuCl2，检测细胞活力
I、J：天然细胞内铜伴侣谷胱甘肽的消耗导致铜依赖性细胞死亡，这可以在LIAS敲除后缓解
K：检测 Atpb7b-/- 小鼠与对照组肝脏的蛋白质含量

七、总结

前面我们已经分析过细胞凋亡、焦亡、自噬、程序性坏死以及铁死亡等，相关信号通路解读、文章和视频讲座等资源都汇总到了小优的学术中心的细胞死亡大合集，有需要的戳链接自取呦。在此项研究中，作者证明了一种与现有已知的所有细胞死亡机制都不相同的新机制，取名为铜死亡（Cuprotosis）。

铜死亡依赖于线粒体呼吸——铜离子通过直接结合三羧酸循环途径中的硫辛酰化蛋白，导致硫辛酰化蛋白异常聚集，并干扰呼吸链复合体中的铁硫簇蛋白，引起蛋白质毒性应激反应，最终导致细胞死亡。在此过程中，FDX1和参与蛋白质硫辛酰化的六个基因是促进铜诱导死亡的关键基因，这些基因对线粒体有氧代谢至关重要。

图7：铜死亡机制示意图

在疾病研究方面，多种癌症(包括乳腺癌、肺癌、胃肠道癌、口腔癌、甲状腺癌、胆囊癌、卵巢癌和前列腺癌)患者的肿瘤或血清中，铜水平会异常升高。过量铜积累会危及生命，但可能存在一个窗口，使得细胞内铜的更集中增加可用于选择性杀死癌细胞。新近发现的铜死亡为铜与癌症的关系提供了思路。铜离子载体Elesclomol可结合环境中存在的铜并将其带入细胞以诱导细胞死亡。Elesclomol 可能在表达大量硫辛酰化线粒体蛋白和高度呼吸的癌症中效果好。这种方法可能对天然抵抗细胞凋亡的癌症特别有用，通过利用这种金属的作用，可以找到一种杀死癌细胞的新方法。

基于铜的抗癌机制，目前铜螯合剂和铜离子载体在多种肿瘤中已进行临床前及临床研究。其中铜螯合剂四硫钼酸盐（TTM） 、ATN-224 在乳腺癌中已经入II期临床试验。铜离子载体双硫仑（DSF）治疗恶性胶质瘤进入II期临床试验，Elesclomol治疗黑色素瘤也进入了II期临床试验。

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