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Western botting实验中，样品一旦准备好，样品蛋白质通过  PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，这可以在天然或变性条件下进行。蛋白质印迹指南的这一部分详细介绍了您在分离蛋白质时可能需要考虑的事项。

本文主要涉及以下几个方面：
·  聚丙烯酰胺凝胶
·  缓冲液 pH值
·  用分子量标记确定蛋白质大小
·  阴性组织对照
·  上样对照

SDS-PAGE通常用于WB实验，其中蛋白质被变性及还原以获得它们的初级结构。用SDS分子（Sodium dodecyl sulfate）包被会产生与其分子量成正比的相对负电荷，从而允许仅按大小分离蛋白质。Native PAGE的使用（不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳），一般常用于观察不同的蛋白质特征。它很少被进一步使用在WB实验中，更常见的是用考马斯或银染色。Native PAGE中的蛋白质迁移率取决于电荷和流体动力学的大小，这些因素都是由多肽折叠决定的。以特定方式折叠的小蛋白质可能比更大、更紧密折叠的多肽具有更大的流体动力学尺寸。此外，可以保留多聚体结构。

SDS-PAGE是通过将蛋白质引入丙烯酰胺凝胶基质并施加电流将带负电荷的蛋白质拉过凝胶来运作的。丙烯酰胺凝胶基质的密度阻碍了蛋白质的转运。较小的蛋白质比较大的蛋白质能够更快地通过凝胶，在电泳期间通过凝胶更远，并且看起来更接近凝胶的末端。相反，较大的蛋白质抵抗迁移并保持更接近凝胶的开始。包含已知大小的蛋白质marker可以与样品同时上样，以校准分离蛋白质的大小。

也可以使用其他类型的凝胶，这些凝胶通过大小以外的特性分离蛋白质。例如，等电聚焦凝胶 (IEF) 凝胶根据蛋白质的等电点 (pI) 分离蛋白质，该等电点对应于蛋白质不带净电荷的 pH 值。除了凝胶本身之外，这些其他类型的凝胶通常还需要专门的缓冲液和分子量标记。

将蛋白质样品装入样品孔中，在夹在两个缓冲液室之间的聚丙烯酰胺凝胶中形成细⻮。垂直电泳仪如图 1 所示。

图 1. 垂直电泳仪

第一个室连接到阴极，样品上样孔暴露在此处，第二个室连接到凝胶末端的阳极。施加电压，蛋白质通过凝胶向阳极移动。

蛋白质大小和凝胶基质的密度决定了分离的速度；较小的蛋白质比较大的蛋白质迁移得更快。

准确的蛋白质定性和定量需要高质量的分离，因此需要选用适当的凝胶特性和上样浓度来确保蛋白质的充分分离。

聚丙烯酰胺凝胶

1. 聚丙烯酰胺凝胶用作分离基质

坚固、亲水、热稳定、透明和相对化学惰性的性质，确保了凝胶在过程中不会破裂或熔化，并且蛋白质很容易被观察到。化学反应不会干扰蛋白质的迁移，并且由凝胶密度控制的孔径可以变化。

2. 不连续聚丙烯酰胺凝胶

PAGE 中使用的大多数凝胶由两个凝胶区域形成：由较低密度凝胶制成的浓缩凝胶和较高密度的分离凝胶。

较小的蛋白质通过浓缩胶快速迁移，并阻碍了通过分离胶的迁移；较大的蛋白质通过浓缩胶缓慢迁移，并且可能并不会渗透到分离胶中。

3. 梯度凝胶

梯度凝胶用于在同一实验中分离不同分子量范围的蛋白质，从而允许从同一样品中分离低分子量和高分子量蛋白质。凝胶的选择取决于需要分离的蛋白质。

4. 聚合和浇注凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是通过化学或光引发聚合丙烯酰胺单体和 N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联剂的溶液制成的。聚合的化学引发使用过硫酸铵等化合物引发反应，使用 N,N,N ,N-四亚甲基二胺等化合物来稳定链式反应。聚合的光引发使用核黄素，将其添加到溶液中并暴露在玻璃板之间的长波紫外线下，并用水饱和的丁醇覆盖。

5. 高分子量蛋白质

PAGE 可用于分离5至200 kDa 的蛋白质。对于大分子量蛋白质（700–4,200 kDa），琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶更适合用于分离蛋白。

表 1. 不同重量蛋白质的丙烯酰胺凝胶密度适用性。

缓冲液pH值

pH值影响蛋白质迁移；因此，上样缓冲液的pH值必须高于蛋白质的等电点，以维持它们的净负电荷，它们才会向阳极移动。连续密度凝胶在两个腔内使用相同的缓冲液，而不连续密度凝胶则需要一个不连续的缓冲系统。通常使用Tris-glycine缓冲液，其堆积凝胶pH值约为7.0，溶解凝胶pH值在8.0 - 9.0之间。当需要时，可以使用其他专门的缓冲系统。例如，当分离分子量非常低的蛋白质/多肽时，Tricine缓冲液是理想的。

在高pH值溶解凝胶中，半胱氨酸残基之间可以形成二硫键。为了解决这个问题，可以在缓冲液中加入还原剂。如果使用Native PAGE，可以添加一种两性离子氨基酸，如tricine，其缓冲pH值范围为7.4至8.8，作为替代溶液。

用分子量Marker确定蛋白质大小

蛋白质大小根据分子量Markers进行校准。这些Markers由一系列具有已知分子量的蛋白质组成，这些蛋白质与样品同时在平行泳道中运行。

未知多肽的分子量可以通过计算标记物的相对迁移距离 (Rf) 与目标蛋白跑胶的距离相比较来估计。分子量标记也是蛋白质转移效率的有效指标。

预染分子量标记可用于监测电泳过程中蛋白质迁移的进程。在添加免疫试剂之前，还可以通过用染料（例如立春红）暂时染色膜来观察标记物。如果凝胶不进行免疫印迹，可以在电泳后用考马斯亮蓝或银染色来观察未标记的标记物。

图2. 跑胶过程中可能遇到的问题和对应的解决办法

阴性组织对照

阴性对照使用已知不表达靶蛋白的细胞或组织样本。当这些与需检测的未知样品一起上样时，正确的实验结果应该显示为没有与目标蛋白大小相同的对照带。

进行阴性对照实验的目的是识别一抗的非特异性结果。如果阴性对照显示出条带，那么则表示实验中的一抗与样品中的其他蛋白（如培养过程中产生的内源性蛋白质）发生了相互作用，而不是与靶蛋白发生相互作用。

另一种有效的阴性对照是进行没有一抗的免疫印迹实验，通常称为无一抗对照。假如在此类对照实验中显示出阳性对照，那么则表明二抗与样品中的蛋白质发生了相互作用。例如，进行小鼠组织样本的WB实验，并使用HRP偶联的抗小鼠二抗时，假如样本中含有小鼠IgG，则将会与二抗试剂产生相互作用。

上样对照

上样对照用于检测PAGE 的一致性，该对照实验中观察到的信号可用于在定量过程中使孔之间的测定结果标准化。

上样对照的一种形式是测量来⾃每个样品中掺入的蛋白质的信号。这可用于确认在电印迹过程中从凝胶均匀转移到膜上，并可用于在分析过程中使孔之间的信号标准化。在组成样品的组织或细胞中表达的管家蛋白，例如肌动蛋白，可用作上样对照。特别是，他们确认孔中装载了相同数量的样品，并且可以识别样品处理差异。

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