成骨细胞是骨组织中高度分化的细胞，来源于间充质谱系。它们的主要功能是产生称为类骨质的胶原物质，随后被矿化形成成熟的骨骼。已知成骨细胞在其自身谱系（即骨祖细胞、骨衬细胞和骨细胞）内的不同分化阶段与其他细胞交流。然而，最近的研究表明，成骨细胞也与其他骨骼细胞类型交流，特别是关节软骨中的关节软骨细胞。
近年来，骨-软骨串扰的概念引起了人们的极大关注，特别是在关节损伤和疾病方面。对骨组织的直接机械损伤似乎可能通过骨-软骨串扰间接影响软骨组织。
骨细胞感知其物理机械环境变化的主要方式之一是通过沿其基质表面以及细胞外基质（ECM）的腔隙-小管系统（LCS）内的流体运动。这允许产生间质流体流动剪切应力（FFSS），其大小可以根据局部微观解剖结构的变化而变化。机械刺激对骨骼和软骨细胞的影响，以及它们之间产生的串扰，是理解创伤性骨关节炎（PTOA）等疾病的重要因素。然而，这种双组织系统在受控的实验室环境中研究也更加复杂，因此新的方法和模型系统对于实现这些目标非常重要。
爱尔兰huangjia外科医学院（RCSI）医学和健康科学大学、都柏林大学圣三一学院、爱尔兰科学基金会（SFI）先进材料与生物工程研究中心实验团队曾作过一项研究，主要目的是开发和表征体外骨-软骨串扰系统及其对FFSS的反应能力。具体而言，他们评估了振荡流体流动通过暴露于预定水平的FFSS对小鼠成骨细胞和软骨细胞的影响，还研究了受刺激成骨细胞条件培养基对软骨细胞的影响。其次要目的是在这项工作中评估细胞系和原代细胞之间的差异，比较了永生化成骨细胞和软骨细胞系（分别为MC3T3-E1和ATDC5）在不同FFSS水平作用下对其原代对应物的反应。最后，证明了来自机械刺激受损的原代成骨细胞的条件培养基中的可溶性信号可以改变原代关节软骨细胞的表型。
流体流动剪切应力（FFSS）对原代和细胞系成骨细胞增殖和分化的影响
将0.5-3.5 Pa范围内的振荡FFSS应用于细胞系和原代成骨细胞群（分别为MC3T3和MSC-OB）。两种细胞类型在FFSS刺激至1 Pa 时，ALP和钙的水平显著上升（图1 A、B）。然而，在大于1 Pa时，ALP和钙水平均逐渐下降。此外，在大多数情况下，与MC3T3s相比，MSC-OB组中的ALP和钙水平显著更高，表明原代细胞对这种刺激的反应比它们的细胞系对应物更强烈。
图1 不同水平的FFSS对MSC-OBs和MC3T3s在ALP，钙和成骨基因表达方面的影响。（A）两种细胞类型的ALP水平在预定的FFSS水平下，归一化为DNA含量。（B）两种细胞类型中的钙水平在预定的FFSS水平下，归一化为DNA含量。（C） 通过RT-PCR测定MSC-OB细胞中 Collagen、ALP、OCN、OPN、RUNX2 mRNA的基因表达水平。
图1 A、B在ALP和钙水平方面表现出非常一致的趋势。此外，这两个因素在原代细胞中的峰值水平均为1 Pa，这正是它们原位暴露的FFSS的大小。同样，基因表达数据显示，对于所检查的所有成骨因子（OPN除外），峰值水平也为1 Pa。在大多数情况下，与细胞系对应物相比，原代细胞的反应幅度更大。此外，除了OPN在这个水平上略有增加，大多数被测量的基因在较高水平的FFSS（3-3.5 Pa）下显示出显著降低的表达。
接下来，进一步研究以确定和优化振荡流参数的频率和持续时间对原代细胞的刺激（1 Pa）和损伤（3 Pa）机制的影响（图2）。刺激状态下使用的FFSS产生合成代谢反应，而破坏状态下产生更多的分解代谢反应，去分化和肥大标记物增加。随着频率和持续时间的变化，在检查的每个频率（1和2 Hz）和每个时间点（1、2和4小时）上，1和3 Pa之间存在显著差异。研究还发现，在大多数时间点，特别是在较长的持续时间下，2 Hz时的表达水平比1 Hz时有所下降。此外，每种细胞类型的钙含量和Col I、RUNX2和OPN水平随着时间的推移相对稳定。
图2 FFSS条件下的频率和持续时间对1和3 Pa的MSC-OBs在ALP，钙和成骨基因表达方面的影响。
（A）已归一化为DNA含量的ALP水平。（B）钙水平归一化为DNA含量。（C） 通过 RT-PCR 检测 MSC-Obs 中 Collagen I、ALP、OCN、OPN和 RUNX2 mRNA 的基因表达水平。
FFSS对软骨细胞增殖和分化的影响
与无流动对照相比，原代关节软骨细胞（ACs）对FFSS的反应也有明显变化（图3）。细胞以与先前实验类似的方式暴露于FFSS（0-3.5 Pa）。最初，AC和ATDC5细胞之间的sGAG含量没有显著差异。然而，1 Pa似乎代表了一个阈值水平，该参数在原代软骨细胞中达到峰值。在所有较高的FFSS量级上，sGAG（人硫酸盐粘多糖）水平逐渐降低。基因表达数据显示，Col II，AGG和Sox9表达水平也在1 Pa时达到峰值，但在不同细胞类型之间存在明显差异。相比之下，Col I 和 Col X 分别在 2/3 Pa 时达到峰值。在所有情况下，与细胞系对应物相比，原代软骨细胞表现出更强烈的反应。
图3 不同水平的FFSS对原代ACs和ATDC5细胞的影响。
（A）两种细胞类型的sGAG水平归一化为DNA含量。（B） 通过 RT-PCR 检测 I 型、II 型和 X 型胶原、SOX9 和蛋白聚糖 mRNA 的基因表达水平。
基于图3的数据，然后使用刺激性（1 Pa）和破坏性（2 Pa）模型来确定原发性ACs如何对频率和持续时间的变化做出反应（图4）。实验发现，在每个应力水平下，增加频率和持续时间往往会降低sGAG含量和Col II、AGG和SOX9表达，相比之下，在相同条件下会增加肥厚标记Col X和Col I的表达。
图4 FFSS条件在1和2 Pa下对原代ACs的频率和持续时间对sGAG和基因表达的影响。（A） AC sGAG水平与DNA含量归一化。（B） 通过 RT-PCR 检测 ACs I 型、II 型和 X 型胶原蛋白和 SOX9 的基因表达水平。
FFSS诱导的成骨细胞衍生的可溶因子对软骨细胞的影响
最后，通过使用条件培养基实验来确定FFSS诱导的成骨细胞衍生的可溶因子对软骨细胞表型的影响。图5表明，在刺激性 FFSS 水平（即 1 Pa）下，可溶性成骨细胞衍生因子导致软骨细胞中 sGAG 的产生与对照水平相比增加。然而，在2、3和3.5 Pa处响应FFSS产生的可溶性因子导致sGAG含量较对照和峰水平降低，并且在基因水平上蛋白聚糖也发现了这种效应。令人惊讶的是，Col II基因在1 Pa时表达量的增加在该系统中并不明显，并且对照组在2、3和3.5 Pa时的表达量与之前一样。同样，与高FFSS水平的对照组相比，SOX9的表达也减少了。Col I在2 Pa时表达量无显著增加，而在3和3.5 Pa时表达量较1 Pa时减少。在Col X的情况下，表达谱与Col I有些相似，峰值为1 Pa，随后在3和3.5 Pa处显著降低。
这些数据表明，暴露于受刺激的成骨细胞衍生因子可能对AC表型产生显著的幅度依赖性影响。
图5 FFSS 诱导的可溶性成骨细胞衍生因子引起的软骨细胞表型变化。
（A）暴露于FFSS诱导的可溶性成骨细胞衍生因子后，ACs中的sGAG水平归一化为DNA含量。（B） 在暴露于条件培养基后 3 天后ACs 胶原 I、II 和 X 胶原蛋白、SOX9 和蛋白聚糖的基因表达。
总之，该研究开发了一种基于原代细胞的新型系统，可用于概括关节损伤后的成骨细胞损伤应激，以及随后可能通过骨-软骨串扰对软骨细胞产生的有害影响。将来，参与该过程的具体途径可用于确定在软骨细胞中产生分解代谢影响的骨源性因子。这些信息还可以为PTOA和其他相关疾病的新型骨靶向生物学治疗提供信息。
参考文献：Hinton PV, Genoud KJ, Early JO, O'Brien FJ, Kennedy OD. Impact of Fluid Flow Shear Stress on Osteoblast Differentiation and Cross-Talk with Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2022 Aug 22;23(16):9505. doi: 10.3390/ijms23169505. PMID: 36012760; PMCID: PMC9408926.
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