多肽问题汇总解答回复

问: 专肽生物如何对合成的多肽进行质检?

答: 所有合成肽都经过HPLC和MS分析，并提供相应的检测报告。所有多肽均采用反相色谱法纯化，以质谱法测定肽的分子量来确定产品是否正确，MS检测结果还可显示大部份的主要杂质。所有交付的肽均达到了客户要求的纯度。没有达到纯度要求的那些多肽均被丢弃。当然如果客户需要，也可以发送给他们。

问: 如何解释MALDI(MS)中的P+Na 和P+K峰?

答: 经常会在MALDI中看到Na峰和K峰，钠和钾来源于溶剂水。即便是蒸馏水和去离子水也会 含有痕量的钠离子和钾离子，无法*除去。它们在进行质谱分析时也会离子化并与肽的自由羧基结合。因为没有纯化水的系统将水中的钠离子和钾离子除去，所以有时候在MALDI MS图谱中出现钠峰和钾峰也是再所难免的。

问: 为什么要进行N端乙酰化，C端酰胺化修饰?

答: 这些修饰可以使肽不会被降解掉，也可以使肽模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。

问: 如何将多肽溶解在DMSO中?

答: 二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3)2SO，常温下为无色无臭的透明液体。DMSO作为冷冻保护剂经常应用于细胞库。在细胞冷冻过程中，DMSO可防止胞内/胞外晶体的形成，其工作浓度为10%。DMSO通常可与盐或血清白蛋白结合。

疏水性多肽可以很容易地溶解在DMSO中。但DMSO可增加细胞的通透性，若多肽溶解于DMSO中则会对细胞产生毒性作用。高浓度的DMSO绝不可应用于细胞培养中。浓度为5%的DMSO即可让细胞膜溶解。大多数细胞株可以容忍0.5% DMSO，少许可以容忍1%的浓度，而不表现出严重的细胞毒性。然而原代细胞培养对其更敏感。所以如果是用原代细胞做剂量/反应曲线(可行性)，其浓度应低于0.1%。

对于某些疏水性非常高的多肽，可先尝试将其溶解在少量的DMSO(30-50ul,1，0，0%)中，然后慢慢 (一滴一滴地)将其添加到不断搅拌的水溶液如PBS或其他想要的缓冲液中，直至理想浓度。如果滴加过程中，肽溶液开始变浑浊，说明已经达到了溶解极限。另外，超声波有助于多肽溶解。

经验:

对几乎所有的细胞来说，浓度为0.1%DMSO是安全的。

广泛被用于细胞培养的DMSO终浓度为0.5%，不会引起细胞毒性。

虽然对部份细胞来说，1%DMSO也不会产生细胞毒性，但我们推荐0.5%。

也有5%DMSO成功地应用于某些细胞的案例。

始终保持终浓度在0.5%，但储存时可200倍高浓度溶于DMSO中。

问: 磷酸化修饰多肽的设计有什么建议?

答: 随着长度的增加，从磷酸化的那个氨基酸往后偶联效率逐渐降低。合成方向从C端到N端，建议磷酸化的那个氨基酸以后的残基不要超过10 个，也就是说从N端往C端数磷酸化氨基酸之前的氨基酸残基 好不要超过10个。

问: 如何选择多肽N端修饰和C端修饰?

答: 肽的末端默认为N端游离的氨基，C端游离的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列，为了与母本蛋白更为接近，肽末端往往需要封闭，即N端乙酰化，C端酰胺化，这种修饰避免引入多余电荷，也使其更能防止外切酶作用，使肽更加稳定。

问: 我需要合一条环肽，其中含有一个色氨酸，它会被氧化吗?

答: 色氨酸的氧化是肽氧化中的常见现象，而肽一般是先环化再纯化，如果其中的色氨酸发生了氧化作用，肽在HPLC柱上的滞留时间会发生变化，因此被氧化的肽可以通过纯化去除。另外，氧化的肽也可以通过MS检测到。

问: 如何确定肽已成环?

答: 一般采用Ellman反应来检测成环反应是否*。如果Ellman检测结果为阳性（黄色），说明成环反应不*；如果检测结果为阴性（不是黄色），说明成环反应已进行*。

问: 含有Cys的多肽在出货前经过还原了吗?

答: 如果没有发现肽已经被氧化，我们一般不对Cys进行还原。所有的多肽都是由粗品在pH 2条件 下纯化、冻干后得到的，这样的pH条件至少在某种程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般 在pH 2条件下进行纯化，除非有特殊原因需要在pH6.8条件下纯化。如果纯化在pH6.8进行， 纯化产物必须马上用酸处理以防氧化。在最后的质量控制环节，对于含有Cys的肽，如果MS图谱上发现有分子量为(2P+H)的物质存在，说明Cys已经氧化形成二聚体。如果MS和HPLC都没有问题，我们就直接冻干后出货。需 要指明的是，含有Cys的肽随着时间的推移会发生缓慢的氧化，氧化程度主要取决于肽序列及贮存条件。

问: 荧光标记时，肽和修饰标记的染料之间需要加一个间隔吗?

答: 多数染料属于大分子量芳香族氨基酸，为了避免多肽与荧光标签之间发生相互作用（比如，FITC很容易结合多肽序列中的半胱氨酸残基或者赖氨酸残基。），维持蛋白的构象及其生物学活性，我们推荐引入一个可弯曲的间隔区，比如Ahx, Ahx是一个含有6碳分子的环状结构，可以维持荧光标签的稳定性。

通常情况下，生物素、FITC一类的染料既可以标记在蛋白的氨基端也可以标记在蛋白的羧基端。然而，为了在最短时间内，便捷又高效地合成多肽，固拓生物推荐客户选择标记在氨基端。因为一个多肽的合成往往是从羧基端开始的，这样一来，氨基端的修饰便成为zui后一个环节，不需要再进行特别的结合作用。反之，羧基端修饰需要额外的环节，因此过程更加复杂。

问: 多肽一般有哪几种盐的形式?通过什么方式转盐或脱盐?

答: 多数多肽都是在TFA体系下分离纯化的，所以多肽以TFA盐的形式最多，其次药物肽一般有醋酸盐及盐酸盐的形式，极少数药物肽会有一些特殊的盐形式。转盐方式多为离子交换法和HPLC法，而脱盐可用G25（安马西亚出的一种葡聚糖凝胶）柱。一般醋酸盐及盐酸盐的价格比TFA的价格高出20%-30%。

问: 在多肽检测过程中经常出现基线漂移的原因是什么?怎么解决?

答: 固定(TFA)浓度的梯度洗脱有时会在210-220nm检测处造成吸收基线的漂移，这是许多反相分离中基线漂移的原因。降低或消除由于TFA光谱吸收变化引起的基线漂移需要尽量使检测波长靠近215nm，并在溶剂B中比在溶剂A中少加15%的TFA补偿基线漂移。列如，溶剂A中的TFA为0.1%时，溶剂B中可用0.085%。

问: 影响多肽纯度检测结果的因素有哪些？

答: 影响多肽纯度检测结果的因素很多，主要包括：流动相体系、色谱柱型号、柱温、波长及色谱仪的性能指标，每一项不同都可能造成结果产生误差。

问: 有哪些流动相体系或离子对试剂可用于多肽的分离纯化?

答: 目前，常用的离子对试剂是(TFA)，TFA能调节洗脱液的PH，同时作为离子对试剂与多肽相互作用，从而增强分离效果，明显改善峰形。其它可用于多肽分离纯化的流动相体系或离子对试剂包括醋酸体系，磷酸体系，盐酸体系，七氟丁酸等，通过适当的调节PH都能取得很好的分离效果。