单细胞测序的难点在于如何把不同类型的组织解离成单细胞悬液。目前，主要的单细胞分离方法有口吸法、显微操作法、流式细胞法、微流控。
显微操作法是一种能够直接观察到单细胞分离的方法。这一方法能够准确控制单个细胞的吸取与释放，但是对实验操作的要求较高，不利于规模化操作，FACS则能够大规模获得单细胞样本，该方法是利用流式细胞仪，借助于细胞表面标记分选出特定群体的细胞或单个细胞。
虽然这一方法需要专门的设备，且细胞的消化和分选过程会对细胞状态产生一定的影响，但是该方法的效率和准确率较高，标准统一，有利于不同实验室实验研究的比较，而流式和微流控的方法可以适用于大规模分离单细胞悬液，而大规模分离单细胞首先需要制备细胞活力较高的细胞悬液。
悬液制备和质控中的注意事项：
1、组织样本制备悬液时间不超过4h；
2、单细胞分离悬液中不能含有Ca2+和Mg2+，且不能含有Tween80之类的表面活性剂，否则会影响细胞活性；
3、根据项目的情况选择合适尺寸的细胞筛。细胞尺寸可选20~40μm不等，目的是滤掉杂质和细胞团；
4、解离好的细胞悬液武汉样本库技术服务平台推荐细胞活率为85%以上，低于75%不能上机；
5、细胞悬液的适宜浓度700-1200cells/μL。浓度过高，上样体积太小，误差太大；浓度太低，体积太大，会带入一些杂质和细胞团等；
6、细胞悬液制备完成后要尽快建库，样本制备好到上机的时间间隔不宜超30min。不能保证同时制备多个样本的细胞悬液时，可能导致各样本之间悬液制备间隔时间过长，此时则不建议一次完成多样本建库。
