细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法,前者比较温和,后者虽然产量高,但反应更剧烈,很有可能造成细胞中的DNA断裂。
这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂。
一、机械裂解法主要有以下两种:
1. 热休克,既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成。原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20 ℃冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100 ℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。
2. 超声波处理既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:
(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;
(2)溶解蛋白;
(3)蛋白变性使其稳定;
(4)抑制蛋白酶活性。
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等。