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2022/11/10 10:51:43植物案例
MST技术
植物在整个生命周期中会经受多种微生物病原的侵袭,包括真菌,细菌,病毒,线虫等,作物约30%的产量损失是由病原体造成的,病害是农业可持续发展面临的主要问题。在植物与病原数百万年的协同进化中,植物与病原的互作经历了很多阶段,为掌握植物与病原互作中的重要信号分子,深入了解植物免疫分子机制,不可避免的要进行分子间互作的检测,今天来看一下微量热泳动(MicroScale Thermophoresis, MST)分子互作技术在植物抗病方面的应用吧!
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植物与真菌--蛋白和离子
Gao, Mingjun, et al. "Ca2+ sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector." Cell 184.21 (2021): 5391-5404.
植物如何平衡抗病和生长发育平衡,zhong国科xue院分子植物科学卓yue创新中心何祖华团队研究揭示了以ROD1为免疫抑制中枢,通过降解超氧活性因子ROS,抑制植物的免疫反应,平衡植物防御和生长之间的冲突。
水稻中,ROD1编码一种Ca2+传感器蛋白,以Ca2+依赖的方式结合到磷酸肌醇脂质,靶向至特定膜区域。ROD1刺激过氧化氢酶CatB的活性,促进活性氧(ROS)清除,抑制免疫;当有稻瘟菌侵染时,植物通过降解ROD1减弱其功能,产生有效的防卫反应。作者使用MST技术检测ROD1可直接与Ca2+结合,并鉴定出活性结果位点。
图注:MST技术分析ROD1与Ca2+的亲和力和活性结合位点
另一方面,研究发现病原稻瘟菌中具有与ROD1结构类似的毒性蛋白AvrPiz-t,在植物体内盗用ROD1的免疫抑制途径,实现侵染的目的,进而与病原菌共同生存。通过MST检测到AvrPiz-t与Ca2+结合,进而盗用ROD1途径。
图注:MST技术比较ROD1和AvrPiz-t的Ca2+结合活性
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植物与细菌--蛋白和蛋白(Dimmer)
Xu, Ning, et al. "A plant lectin receptor-like kinase phosphorylates the bacterial effector AvrPtoB to dampen its virulence in Arabidopsis." Molecular plant 13.10 (2020): 1499-1512.
质膜定位受体样激酶(RLKs)感知植物中保守的病原相关分子模式(PAMP),触发免疫(PTI)。拟南芥凝集素受体激酶LecRK-IX已被证明调节细菌鞭毛蛋白来源肽flg22诱导的PTI。而许多病原体分泌的效应蛋白可抑制植物免疫。植物中是否存在某种机制抑制或削弱病菌分泌的效应蛋白的功能?
中科院微生物所刘俊研究组研究发现效应蛋白AvrPtoB是丁香假单胞菌的主要毒力效应子。AvrPtoB C端有一个功能的E3连接酶结构域,以植物中的鞭毛识别受体FLS2和几丁质识别受体CERK1为目标进行降解,导致PTI的抑制。本研究中,作者发现效应蛋白AvrPtoB与拟南芥凝集素受体激酶LecRK-IX.2相互作用并泛素化降解LecRK-IX.2,抑制其介导的免疫。AvrPtoB在体外和体内都能形成二聚体,这种二聚体形成对其E3连接酶与底物的结合和泛素化所必需的。然而, LecRK-IX.2能与AvrPtoB S335位点互作并使其磷酸化,S335的磷酸化破坏AvrPtoB二聚体状态,导致其抑制PTI反应的毒力下降。作者的研究表明,宿主RLKs可以修饰病原体效应器,以抑制其毒性,并削弱其抑制PTI的能力。
图示:AvrPtoB对LecRK-IX.2的泛素化与其被磷酸化竞争模式图
为了检测AvrPtoB与自身以及与LecRK-IX.2亲和力大小,作者进行MST实验。结果表明,AvrPtoB与LecRK-IX.2的亲和力(0.02μM)要远高于其自身形成二聚体的亲和力(18.7μM),表明AvrPtoB更容易与LecRK-IX.2结合。
图注:MST技术检测AvrPtoB自身以及与LecRK-IX.2CD
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植物与病毒--蛋白与离子/核酸/蛋白
Yao, Shengze, et al. "The key micronutrient copper orchestrates broad-spectrum virus resistance in rice." Science Advances 8.26 (2022): eabm0660.
铜是植物生长发育的重要调节剂,然而铜对病毒入侵的反应机制尚不清楚。之前的研究表明,SPL9介导的miR528转录激活为已建立的AGO18- miR528 - L- AO抗病毒防御增加了一个调控层。北京大学李毅课题组研究发现,Cu2+通过抑制SPL9的蛋白水平来抑制miR528的转录激活,进而提高ROS水平,增强AO积累量及其酶活,从而加强抗病毒反应,阐明了铜稳态的分子机制、调控网络以及SPL9-miR528-AO抗病毒途径。
为了检测SPL9和Cu2+之间的直接相互作用,作者纯化了SPL9 DNA结合区域(SPL9 SBP),使用Monolith分子互作仪检测其与Cu2+的互作。结果显示SPL9 SBP直接与Cu2+结合,但不与Ca2+结合。
图注:Monolith检测SPL9与Cu2+亲和力
此外,李毅课题组在2020年研究结果解析了植物体内抗病毒RNAi信号通路,同样用到了MST技术。
Yang, Zhirui, et al. "Jasmonate signaling enhances RNA silencing and antiviral defense in rice." Cell Host & Microbe 28.1 (2020): 89-103.
水稻抗病毒RNAi信号通路的核心蛋白AGO18受病毒侵染诱导,进而增强水稻的抗病毒免疫;但是病毒侵染如何诱导水稻AGO18的了解很少。北京大学李毅课题组发现病毒外壳蛋白(CP)过表达能够诱导水稻茉莉酸(JA)的显著积累,JA信号通路的关键转录因子(JAMYB)能够结合并激活AGO18的启动子,从而诱导AGO18的表达,抑制病毒的侵染。
为了分析AGO18启动子上的顺式作用元件,作者进行了MST实验。将顺式作用元件带上FAM荧光,作为荧光信号源,检测到JAMYB结合在AGO18启动子上的顺式作用元件R3,R3突变后AGO18和JAMYB丧失结合能力,进而确定了该位点对于AGO18转录调控的重要性。
图3. MST检测的JAMYB和AGO18 R3区域的结合(蓝色曲线)
此外,作者通过MST实验发现,水稻JAZ6蛋白能够通过与JAMYB相互作用来抑制其转录激活活性,表明JAZ6抑制水稻抗病毒RNA沉默并损害水稻抗病毒免疫反应。
图2. MST检测的JAMYB和JAZ6的结合
该研究揭示了植物JA信号通路与RNAi信号通路协同参与水稻抗病毒防御的分子机制。
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植物与线虫--蛋白和多肽
Zhang, Xin, et al. "Nematode-encoded RALF peptide mimics facilitate parasitism of plants through the FERONIA receptor kinase." Molecular plant 13.10 (2020): 1434-1454.
植物寄生线虫是全qiu性的粮食作物病虫害之一,然而线虫与宿主植物相互作用的机理仍尚不清楚。植物细胞膜上的受体蛋白FERONIA及其配体RALFs参与调节植物免疫反应。湖南大学和中国农科院植物保护研究所联合解析研究发现FERONIA突变导致植物对RKN表现出低敏感性。另外,作者在6类根结线虫中鉴定了18种RALF-like基因,编码的小肽可以直接结合到FERONIA的胞外结构域,从而“挟持”植物FER信号途径,破坏植物免疫系统,促进寄生。
研究时,为了检测了线虫RALF- like小肽 MiRALF1/3是否同拟南芥At-RALF1具有相似的FER结合模式,作者使用MST进行检测。结果显示MiRALF1/3与FERECD亲和力分别是25μM和64μM,而AtRALF1亲和力略高,Kd为1.7μM,证明了线虫RALF -like具有植物RALF的典型活性,且可以结合FER。
图注:MST检测FERECD与AtRALF1、MiRALF1或MiRALF3之间的亲和力
新一代分子互作仪 Monolith X