轻松测试组织和细胞的机械性能！
Optics11结合*Piuma技术基础上开发设计出了结构紧凑灵活的PIUMA Chiaro。这种纳米压痕模块可以放置在任何显微镜，允许在最小的样品或者特征上进行非常精确的压痕实验。单细胞压痕实验终于被变得非常简单了！该系统在液体中表现特别好。只要插入探头就可以开始压痕测试！Chiaro人体组织和软材料的机械性能Chiaro人体组织和软材料的机械性能
Chiaro细胞压痕仪
题目：基体刚度对梗死边界机械耦合和力传播的影响
（如果需要完整文献请与我们工作人员联系，可试样）
简介：异质细胞间耦合在心脏的机械和电信号传输中起着重要作用。尽管许多研究已经研究了心肌组织内肌细胞和非肌细胞之间的电信号传导，但研究机械对应物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心脏病发作模拟基质僵硬条件下，底物硬度和心肌成纤维细胞（CMF）的存在对心肌细胞（CMs）和CMFs机械力传播的影响。使用集成了与 CMF 集成的生物纳米压痕仪测量了 CM 产生的收缩力及其在 CMF 中的传播荧光显微镜用于快速钙成像。我们的结果表明，较软的基质有助于更强和更进一步的信号传输。有趣的是，CMF的存在以刚度依赖的方式衰减了信号传播。与具有CMF的软基质相比，存在CMF的较硬基质使信号衰减约24-32%，表明心肌梗死后基质刚度增加和CMF数量增加对心肌功能具有协同不利影响。此外，CMF运动在CM-CMF边界处的跳动模式也取决于基板刚度，从而影响CM产生的收缩力的传播波形。我们进行了计算机模拟，以进一步了解不同力传递模式的发生，并表明在CM-CMF界面处组装的细胞-基质粘附（根据基板刚度而不同）在决定信号传输的效率和机制方面起着重要作用。总之，除了底物刚度外，受底物刚度影响的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的程度和类型也会影响心肌组织中肌细胞和非肌细胞之间的机械信号传导。
1.介绍
心肌梗塞（MI）是死亡的主要原因之一）。MI导致心肌中疤痕组织的形成，与健康组织相比，心肌具有不同的机械性能和细胞组成（）。具体来说，梗死组织已经显示出更硬，测量的刚度为100-1000 kPa（，），而健康组织的硬度仅为∼10-20 kPa（）。在健康的心脏组织中，心脏成纤维细胞（CFs）占心肌细胞的∼45-75%，取决于物种（）。成年哺乳动物心脏的再生能力有限。在像心肌梗死这样的损伤后，丢失的心肌细胞（CM）被纤维化疤痕组织）所取代，该组织主要由损伤区域附近的CF形成。在此过程中，CF转分化为心肌成纤维细胞（CMF），并构成疤痕组织细胞群的重要组成部分。疤痕组织的形成触发周围心肌（重塑）。早期的研究表明，纤维化引起的僵硬增加可归因于胶原细胞外基质（ECM）的过度积累和交联）。总的来说，CMF介导的纤维化组织形成，基质硬度增加和CMF数量增加会损害心脏收缩力和功能。因此，更好地了解CM和CMF之间的结构和功能相互作用以及机械微环境对这种相互作用的影响对于开发新的心脏疗法是必要的。
各种研究表明基质硬度，外部机械刺激和CMF的存在对心脏收缩力（的影响）。ECM硬度的增加也被证明会影响CM分化和成熟。然而，大多数这些早期研究都集中在CMs和CFs之间关于底物刚度的电渗耦合或研究传导速度的变化，以响应非肌细胞（即CFs或CMF）群体的增加（）。除了电渗耦合，机械耦合在确定心肌细胞（信号传播的效率方面也起着重要作用。然而，关于机械信号在CM-CMF边界上的传播以及基板刚度对机械传播距离的影响的文献仍然有限。最近的研究很少调查外部机械刺激对CMs（产生的收缩力的影响。尽管这些研究研究了机械微环境对CM收缩性和CM-CM耦合的影响，但据我们所知，这些研究都没有研究CMF中收缩力传播的大小和距离。
本研究通过CMs和CMFs在不同刚度基质上的微模式共培养，模拟健康和梗死心肌，并研究了CM-CMF界面上CMF之间的机械信号传播。为此，我们制造了具有14、83和484 kPa刚度的底物，以模拟健康（15 kPa）（6），1周（50-100 kPa））和2至周（200-1000 kPa）（）MI梗死后组织，分别使用生物相容性弹性聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）。为了研究CMF的存在对机械信号传播的影响，我们在微图案衬底上接种了含有约30%CFs（23）的CM悬浮液混合物，并通过CFs的自增殖和分化为CMF形成CM-CMF边界。 通过驻留测量在单细胞水平上测量CMs和CMF的收缩力（14， 24）使用生物纳米压痕（）。 这里使用的停留测量方法类似于用于测量细胞应力松弛行为的技术（27）。简而言之，将细胞压痕到一定程度，并且压痕探头与细胞保持接触30秒。跳动引起的电池高度变化导致悬臂偏转的变化，这对应于电池沿横向施加的收缩力。使用停留测量方法，我们已经表明心肌的微环境特性，如基质硬度和CMF的存在，在调节跨MI边界的机械传导中起着关键作用。研究了CMs和CMFs收缩力的大小和模式，阐明了梗死组织中机械信号传播的机制。除了机械表征外，我们还对细胞-细胞偶联蛋白和粘附进行了生化分析。CMF通过其应激纤维中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达来鉴定（）。最后，我们使用有限元分析（FEA）模型来理解和验证我们的实验结果。有趣的是，我们发现CMF的存在会根据基板刚度衰减机械信号。此外，我们还发现CM-CMF界面处的细胞-基质粘附分布控制着CM-CMF边界处的跳动波型。了解组织微环境对常驻心肌细胞的影响是改善心肌治疗的关键一步。这项研究的结果对于理解CMF的存在和ECM硬度对健康和梗塞心脏的细胞相互作用和功能的影响可能很重要。
采用不同比例的碱/固化剂制备不同刚度的PDMS基底，研究基质刚度对细胞功能和行为的影响。我们分别使用1：100、1：40和1：20碱/固化剂比例组合制备了三种不同的基材，其刚度约为14 kPa（软）、83 kPa（中等）和484 kPa（刚性）。准备好混合物后，将它们脱气并倒在普通玻璃盖玻片（直径= 30 mm）上，以750 rpm旋转30秒，然后烘烤。1：40和1：20 PDMS样品分别在80°C下烘烤5和2 h，而1：100 PDMS样品在95°C下烘烤13–14 h以固化。固化后，使用惰性硅胶将PDMS涂层玻璃基板粘合到35-mm培养皿上，以防止样品在纳米压痕仪测量期间移动，用等离子体放电处理1分钟并浸入去离子水中直至基板功能化。
在本研究中，制备了以下两组样品：共培养样品（即CM-CMF）和不含任何CMF的对照样品（即单个CM培养物）。对于这两种样品，在细胞接种前用FN涂覆底物，以促进细胞附着在PDMS底物上。将FN溶液（50 μ g/mL）以液滴形式置于底物中心，并将样品在37°C下孵育1 h。蛋白质孵育后，除去溶液，洗涤样品并保持在PBS中直至细胞接种。在共培养样品中，为了在基板上形成细胞附着的图案，如前所述，使用厚度为100 μm的PDMS薄膜薄条在细胞接种期间部分阻断细胞培养底物（图1 A）。去除条带后，CF细胞增殖，迁移并在涂层表面的另一半分化为CMF。对于对照样品，我们将PDMS条带放在基板上，然后用FN涂覆，并将其留在整个细胞培养物中，以防止细胞迁移和基质另一半的生长。将PDMS条带放置在FN包被之前有助于条带更牢固地粘附在基材上，并防止在更换培养基期间出现任何脱落，直到我们在细胞培养的第5天，即驻留测量之前剥离条带。
使用Piuma Chiaro纳米压痕系统（Optics11，荷兰阿姆斯特丹）（26）测试天然心脏组织块，具有不同刚度的PDMS底物以及PDMS底物上培养的CMF细胞的硬度。
使用直径为90 μm的胶体探针测试具有不同刚度的PDMS基板。用于软基板的压痕探头的弹簧常数为0.43 N/m，而用于中等和刚性基板的探头的弹簧常数为4.21 N/m。针对每个PDMS底物条件测试了三个单独的样品，并从每个样品的不同位置记录了多个测量值。所有样品共记录了204-390个压痕数据点。
用于在PDMS衬底上接种的CMF的压痕探头的弹簧常数和直径分别约为0.045 N / m和41 μm。针对每种底物类型，在两个独立样品上总共测试了45种不同的CMF细胞。在测试之前，悬臂的灵敏度校准是通过压痕硬表面（即载玻片）进行的。使用的加载速度分别为 50、2 和 0.2 μm/s。开发了一个定制的MATLAB代码（The MathWorks，Natick，MA），以确定探针和样品之间的接触点，并使用赫兹接触模型（27，33）识别样品的杨氏模量：
其中F是施加的力，δ是压痕深度，R是胶体探针的半径，E是样品的杨氏模量。假设样品是不可压缩的（即泊松比为0.5），因为使用该模型的文献研究得出的结论是，当泊松比从0.3到0.5变化时，测量的性质变化小于20%，因此，假设大多数生物样品的不可压缩性是合理的).使用单因素方差分析进行统计，以95%置信水平报告统计学意义（p < 0.05）。
通过驻留实验用纳米压痕仪测量细胞片内单个CM和CMF的收缩力。简而言之，将纳米压痕探针与样品接触，并且探针的位移保持恒定（换句话说，探针驻留在样品上）30秒以动态测量其偏转，这与电池沿横向相对于基板的收缩力成正比。
首先，我们测量了共培养样品上与CM-CMF边界相邻的单个CM的收缩力，以及没有任何CMF的对照样品上CM-PDMS边界处的CM。然后，依次测量单个CMF的收缩力，每次在距边界更远的距离处测量，如图 A所示，直到没有可检测到的信号。所有跳动力测量均在细胞核上进行，以确保一致性，并尽量减少细胞刚度异质性的影响。每次测量后，悬臂沿X轴移动，并在最近的CMF上进行测量。因此，所有测量都是在距边界相似的距离处进行的，根据最近CMF的确切位置，差异仅为∼5-10%。所用探头的弹簧常数和直径分别为0.067 N/m和5.4 μm。开发了定制的 MATLAB 代码来分离每个单拍并计算平均收缩力。
为了开发本研究中的FEA模型，通过图像分析和纳米压痕测量测量了CMF的尺寸（即细胞直径和高度）。首先，我们通过测量新附着的球形CMF的直径和高度来计算单个CMF的体积，该CMF在细胞接种后不超过15分钟接种在培养皿上，以确保细胞仍呈球形。简而言之，捕获了这些球形细胞的明场图像，并通过使用ImageJ绘制两条从细胞中心穿过的对角线来测量直径，以获得D0.然后，这些球形细胞的高度，H0，通过使用纳米压痕仪压进细胞及其旁边的基板并记录细胞-基底接触点（）来测量。这些尺寸用于计算细胞的体积V0如下：
最后，我们测量了在不同刚度基材上播种并铺展的CMF的高度。由于扩散的CMF的不规则形状，我们假设细胞体积被保留，而不管细胞的形状调制，同时扩散（）。基于这一假设并使用第V卷0并测量了不同刚度基板上展开的CMF的CMF高度H，我们使用以下公式计算了不同PDMS基板上CMF的直径D：
首先，我们通过纳米压痕实验研究了天然组织基质、具有不同刚度的制备PDMS底物以及在这些基质上接种的CMFs的粘弹性。我们观察到不同PDMS基板的测量刚度的变化取决于压痕的加载速度。PDMS基板刚度是在三种不同的加载速度（即50、2和0.2 μm/s）下测量的，如图B所示。当加载速度从50 m/s降低到2 μ m/s和从2 μm/s（p < 0.0001）降低时，基体的刚度显著降低，但软基体的刚度从50 m/s降低到2 μm/s（p = 0.1484）时除外。同样，在不同PDMS衬底上晶种的CMF表现出加载速度依赖性刚度（p < 0.005），但当加载速度从2 m/s降低到0.2 μ m/s（p = 0.1924）时，在中等衬底上接种的CMF除外（C）。为了进行比较，测量了天然大鼠心脏组织的硬度，该硬度也随着加载速度从50降低到0.2 μm / s（p < 0.05）而降低。
PDMS衬底和在PDMS衬底上晶种的CMF均表现出应变速率依赖性刚度。软底物刚度约为13.9-17.66 kPa，与天然健康心脏组织的硬度相似（即11.33-18.46 kPa （）），因为我们测量的健康成年大鼠心脏为13.32±8.60 kPa，而中度和僵硬底物的硬度分别为83.29-105.71和483.92-529.63 kPa，与早期研究中测量的梗死心脏组织的硬度相当（）. 同样，在软、中和硬基底上接种的 CMF 的刚度分别为 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa。可以看出，正如预期的那样，电池刚度随着基板刚度的增加而增加（）。这种加载速度依赖性刚度与先前在组织和细胞（上的发现一致）。
为了区分共培养样品中的CM和CMF并正确识别CM-CMF边界，用Ca对样品进行染色2+染。来自CA的代表截图2+硬质基板样品上的通量视频（）如图所示。因为只有 CM 表现出 Ca（钙）2+通量，用于在活细胞测量期间实时区分两种细胞类型（图2 A）。我们还开发了一个定制的 MATLAB 代码来测量这些钙的瞬时持续时间2+助焊剂视频。对于接种在软、中和硬基质上的CMs，结果分别为1.00 ± 0.59、1.17 ± 0.49和2.10 ± 0.37 s。基于Ca的代表性CT曲线2+在不同刚度基板上培养的CM的成像如图2D所示。
在这项工作中，我们研究了机械微环境对肌细胞（即CMs）在非肌细胞（即CMF）上的机械信号传播的影响。我们研究了机械耦合以及CM和CMF之间的相互作用在健康和梗死组织模型中的关键作用。据我们所知，我们的研究测量和表征了CM和CMF的收缩力，CM-CMF边界处的力传递及其对基体刚度的依赖性。我们已经证明，较软的基板有助于更强的收缩和机械信号的传输。此外，我们发现CMF的跳动模式取决于基质刚度，在机械信号传输中起着重要作用，这是一个有趣的发现，可能有助于阐明梗死组织硬度和大小对心律失常的影响。我们还确定了粘附的刚度依赖性分布对机械信号传输的作用。该项目的结果将帮助我们更好地了解疤痕组织的影响，这将有助于探索梗塞和心律失常等心肌病的新疗法。
