利用Turbiscan开发“评价疫苗铝盐再分散能力”的新方法

背景

目前最广泛使用于人类和牲畜疫苗的佐剂仍是铝盐佐剂。铝佐剂化合物包括铝盐，如磷酸铝AlPO₄和氢氧化铝Al(OH)₃，在疫苗佐剂领域中一般称做“明矾(铝盐)”。一般认为抗原必须吸附到佐剂的表面上从而提供充分的免疫原性。通常情况下明矾佐剂一方面充当免疫系统刺激物，同时另一方面作为抗原库向给予(例如通过注射)的部位提供持续性的抗原释放来刺激身体中抗体的产生。已知天然形式的铝佐剂通常称为凝胶，其为水性介质中的颗粒悬浮液。明矾-佐剂化疫苗的储存和运输是比较特殊的。冻干 (冷冻干燥)通常作为一种用于不同蛋白制剂的长期储存的手段。然而,并不能在不对佐剂的结构造成破坏的情况下冷冻干燥含有铝盐佐剂的商用疫苗。冷冻干燥引起佐剂的凝胶结构的崩塌，导致再悬浮于水中时佐剂盐的团聚和沉淀。一旦出现难以分散的硬沉淀，后果是显著降低了疫苗的免疫原性即药效性。

在一项关于明矾沉降行为的研究中，辉瑞发现，由于沉降过程是逐渐变化的，所以了解它们变化的参数并能够测量出这些参数是很重要的。辉瑞随后解释说Turbiscan^®(法国Formulaction)提供了一种分析这些参数的新方法

介绍

诸如铝盐（明矾）等佐剂通常添加到疫苗中以增强其免疫反应。这些佐剂可以聚集，然后随着时间的推移由于它们的电荷而沉淀。由此产生比较致密的硬沉淀，并且很难再分散。如果随着储存时间的推移这种现象不断恶化，那么就会出现严重的问题，我们知道：

  • 注射剂量保持不变（当硬沉淀出现，聚集物较大且致密，所有活性成分并不会都能通过注射器针头。）

  • 前面也提到免疫原性降低，治疗效果也会降低。

在本文中，我们提出了一种铝盐疫苗再分散性能的快速评估新方法（少于30分钟）

技术性

Turbiscan^®技术基于静态多重光散射，发送光源（880 nm），并在样品整个高度上获取后向散射（BS）和传输（T）信号。通过在一段时间内以合适的频率重复此测量，仪器能够监测物理稳定性。

常规方法：SVR（沉降体积比）

大昌华嘉公众号之前的文章里面提到，传统方法是通过SVR方法在24小时后确定疫苗沉淀量。SVR是沉降层高度与初始悬浮物高度的比值。SVR值越大（>0.1），悬浮性/再分散性越好，因为沉积物越不致密。这一比率可以通过Turbiscan的反向散射光检测器获得的数据中进行计算，如下图所示。

为了防止免疫原性的丧失，溶液要控制絮凝（通过改变pH值或离子强度）。这可以让疫苗形成松散絮状物的弱粘结颗粒，并产生易于再分散的低密度沉积物（大量水被截留）。

新方法：Sonset（沉降开始时间）

尽管SVR方法非常可靠，但24小时对于质量控制或日常工作来说仍然太长。沉降开始时间（Sonset）似乎更方便，因为它的响应速度快（少于30分钟）。Sonset方法是根据悬浮液由于沉淀作用上层溶液达到对应的澄清度（具体保密）的响应时间。

Sonset由传输信号确定，可由软件一键计算并获得。

Sonset方法的验证：

为了验证Sonset作为一种新的筛选方法，用不同pH值（3至9）的AlPO4悬浮液、离子强度（0至1000 mMmol NaCl）（含或不含模型抗原（BSA、溶菌酶））测定24小时SVR与Sonset之间的关系。

取20mL悬浮液并加入到Turbiscna专用样品池中进行测量。每个数据集的收集时间为24小时。如上所述，分别从透射和反向散射数据中获得每个样品30分钟后的沉降开始时间（Sonset）和24小时后的沉降体积比（SVR）。

而结果如下（图3），2段絮凝水平的斜率曲线，可以用来判断样品系统是硬沉淀（陡坡）还是软沉淀（缓坡）。

1.当悬浮液发生硬沉淀时（例如：低pH且无NaCl），AlPO₄仍然是分散颗粒（<3μm），导致沉降速度慢（Sonset>60min），从而防止溶剂在沉积物中滞留。它往往会压缩成一个很硬的沉淀层，很难再分散。SVR值较低（<0.1）也是反映了这一点。

2. 当悬浮液发生软沉淀时（中高pH值或/和高离子强度）中，絮凝体的松散结构很难保存在含有大量截留水的沉积物中。最终沉积物的体积相对较大反映为较大的SVR（>0.1）。沉积速率很高（Sonset<30分钟），并且强烈依赖于絮凝水平（陡坡）。控制这些特性可以保证沉积物的良好再分散，并通过扩展其免疫原性。当Sonset值最低，药效性也最强。

结论

Turbiscan有助于设计适当絮凝的明矾配方。通过改变配方pH值、离子强度和抗原数量，可以确定有利于絮凝系统的理想条件。使用上述沉降特性化方法（SVR和Sonset）有助于做出决定。Turbiscan分析的Sonset和SVR数据可以区分了AlPO₄配方的沉淀类型。最后，由于分析时间要短得多，Sonset值可以代替SVR数据作为表征悬浮液的再分散性能评价的参数的新方法），更适合配方筛选活动。

Turbiscan是一种强大的工具，可用于任何乳剂或分散体，在制药工业中有多种应用，可用于配方开发过程、常规测试或质量控制中。我们的客户可以全面和快速表征他们的配方稳定性。Turbiscan的一次测量可以在30秒内完成，使用Turbiscan测量稳定性和进行货架期研究比简单的视觉分析快200倍。

沉淀现象的Turbiscan数据图