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2022/12/8 10:22:03实验背景
Fragment-based drug discovery(FBDD),是先导化合物发现的主流方法之一。它利用核磁共振技术(NMR)、X-射线单晶衍射(X-ray)以及热迁移分析(TSA) 等方法筛选出与靶蛋白有弱相互作用的小分子片段,之后基于其结构信息对活性片段进行优化,进而得到更高活性的先导化合物进行新药的研发。
在筛选小分子片段时,NMR能在接近生理条件的溶液中获得结合部位信息以及Kd,但其缺点为只能检测比较小的蛋白,且样品消耗量大。X-ray则需要先制备蛋白晶体,并且蛋白晶体和其在溶液中的构象可能会有差异。此外,这两种方法都需要非常昂贵的设备,通常只能在专用的平台由专业操作人员协助开展实验。
TSA(Thermal shift assay)通过检测蛋白的熔解温度Tm变化来进行蛋白结合配体的筛选,其检测速度快,实验门槛低。因此我们可以先使用TSA进行初级筛选,之后结合NMR或X-ray进行验证。TSA的主要技术有染料法以及无标记的nanoDSF技术。在之前的文章中我们已经介绍过这两种技术的原理及对比, 小编今天将和大家分享荷兰癌症研究所(NKI)的研究人员发表在JoVE实验视频期刊基于nanoDSF技术建立的片段化合物库筛选Protocol。
doi:10.3791/62469
实验演示
实验小贴士
使用蛋白纯度大于95%的均一蛋白
蛋白检测浓度通常为200μg/ml, 本文中筛选768个化合物片段消耗~12ml蛋白,仅2.5mg
需要提前评估DMSO对蛋白的影响,本文中DMSO终浓度为0.2%
操作演示
1. 样品配置
使用Mosquito robot进行片段化合物配置_哔哩哔哩_bilibili
使用Mosquito robot进行片段化合物配置
2.nanoDSF检测
使用Prometheus蛋白稳定性分析仪进行TSA筛选_哔哩哔哩_bilibili
使用Prometheus蛋白稳定性分析仪进行TSA筛选
3.实验小结
基于此Protocol,研究人员对三种蛋白(癌症高表达蛋白 Hec1,单极纺锤体蛋白激酶1 Mps1及新冠非结构蛋白5,nsp5)进行了DSi-Poised library(768个片段)的筛选。
研究人员指出使用搭载nanoDSF技术的Prometheus蛋白稳定性分析仪在进行TSA筛选时有以下优势:
样品消耗量低,要比其他方法少几个数量级
除Tm外,还可同时检测样品的聚集情况。
传统DSF方法,染料可能会干扰蛋白与配体间的结合
除了无标记nanoDSF检测模块外,Prometheus蛋白稳定性分析仪还可搭载动态光散射(DLS),静态光散射(SLS)和背反射(Backreflection)模块,只需要10μl样品就可以完成均一性,热稳定性,胶体稳定性的检测。同时我们还提供自动化解决方案,便于客户进行无人值守的高通量筛选。
机械臂自动上样
NanoTemper用户介绍
荷兰癌症研究所(NKI)成立于1913年,是荷兰wei一的专业癌症中心,一直以来也肩负着国际化科学与临床专业知识、发展及培训中心的重要角色。该中心位于阿姆斯特丹,提供荷兰国nei zui 佳的癌症治疗,并曾推动了多项科学突破。(图片来源bai du)
[1] Ahmad M , Fish A , Molenaar J , et al. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery[J]. Journal of Visualized Experiments, 2021(171).