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胰腺四周布满了十二指肠和胆总管等高度血管化的器官。胰腺癌经常侵袭并转移至周围的器官以及更远位置的器官，例如肝脏、腹膜、肺、大脑、肾脏和骨骼。传统的化疗加放疗或疾病晚期的化疗加靶向药物治疗可以延长患者的生存期。但是，即使肿瘤局限的患者中，也仅有40%左右的患者能够达到5年的生存期。这就说明亟需为所有胰腺癌患者改善传统和免疫疗法。肿瘤细胞可以逃避治疗并继续生长。另外，肿瘤微环境中的基质细胞也是促使持续性肿瘤生长的关键支持土壤。了解肿瘤微环境中的所有细胞的免疫状态对于理解肿瘤转移和改进癌症治疗方法至关重要，尤其是免疫疗法。

在本研究中，使用了数十个生物标志物研究胰腺导管腺癌（PDAC）组织中的肿瘤异质性。使用Cell DIVE^™超多标组织成像整体分析解决方案，数十个生物标志物可表征肿瘤微环境中的细胞异质性、细胞活性和细胞间的空间位置关系。我们检查了肿瘤、基质各成分和免疫细胞对肿瘤微环境的影响。所使用的生物标志物组合可用于检测肿瘤相关的基质成分和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、血管生成、肿瘤转移、侵袭、炎症、缺氧、代谢和免疫反应。我们发现这些异质性作用经常都是相互影响的。例如，肿瘤内一些分区会适应缺氧条件并因此导致区域内绝大多数细胞增殖失控。另外，这些缺氧区域缺乏免疫细胞。超多标组织全玻片成像支持对肿瘤微环境中的细胞活动进行空间分辨组织分析，包括对细胞间相互作用和组织免疫状态的研究获得全新的认识。

在本研究中，使用商业来源（Pantomics）获得的胰腺导管腺癌的FFPE样本。抗体经过了严格的标准验证过程（Gerdes等，2013）以确保抗体的结合性能类似于组织一抗/二抗间接标记。本研究中使用了不同供应商提供的三十个生物标志物，均作为商业偶联抗体或者自行偶联。使用Leica Bond（徕卡生物系统）对玻片进行循环染色；在Cell DIVE上使用四通道+DAPI成像玻片，并对图像进行自动化自发荧光移除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的zhuan li软件拼接图像进行导入、融合、可视化和分析。该软件将于2023年上半年上市。

使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案，用30个生物标志物循环染色了一个PDAC FFPE切片，确定侵袭性肿瘤细胞的空间状态。本研究中使用的标志物在空间上确定了肿瘤内的代谢和缺氧、凋亡、上皮间质转化和免疫细胞状态（图1 A）。在使用全套30个生物标志物进行细胞分割后，一小部分生物标志物被用来对肿瘤的异质区域进行分类和空间表征（图1B）。具体来说，缺氧标志物Glut1和两个PanCK生物标志物区分出了葡萄糖摄取量增加的癌细胞，这是一个癌症标志。通过这种方式，将肿瘤中侵袭性较强区域的细胞类型与侵袭性较弱区域或正常组织的细胞分开分析，可以减少异质性。量化各区域的免疫贡献，常氧肿瘤和正常胰腺与缺氧肿瘤区域相比，缺氧区域的淋巴细胞和其他免疫细胞总体减少，尽管所有区域的细胞总数接近（图1D）并显示了代表性的表型图像（图1D底部）。

通过聚类分析无偏差性的确定了细胞亚群。聚类分析和降维显示，与其他区域相比，缺氧肿瘤区域的该细胞群体较少（图2）。与基于表型的免疫细胞计数类似，在缺氧肿瘤区域存在极少的淋巴细胞（图2C聚类和UMAP）。有趣的是，几个聚类显示了具有明显胶原沉积的癌症相关成纤维细胞（CAFs）群体（图2C；橙色方框）。此外，对空间聚类关系的分析清楚地确定了与CAF（肿瘤相关成纤维细胞）在同一空间邻域中常见的细胞类型（图2C；邻域图）。例如，聚类5（SMA+基质集群）和聚类8（免疫细胞；CD45+，胶原蛋白+）是聚类16（SMA+胶原蛋白+；ClAP1+）的共同邻居，表明炎症和肿瘤导致的结缔组织增生通常与PDAC患者的不良生存结果有关²。