高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
如果操作不当，即达不到预期的灭菌效果。在操作高压灭菌器有以下几点注意事项
1、汽未放尽前，不得开启高压锅；
2、如果灭菌后的培养基在锅内不及时拿出，需在蒸汽放尽后将锅盖打开，切忌将培养基封闭在锅内过夜。
3、压力表指针在0.05MPa以上时，不能过快放汽，以防止压力急速下降，液体滚沸，从培养容器中溢出。
4、操作过程，请注意安全，小心烫伤。
在一个标准大气压下水的沸点是100摄氏度，压力越高,与之对应压力下的沸点越高，这里是高压蒸汽锅,说明压力肯定大于一个标准大气压(通常情况下的地表面的大气压强就认为是一个标准大气压)，也就是说高压蒸汽锅肯定要超过100摄氏度才能沸腾，才能产生蒸汽。至少要等到水煮沸，排出一分钟左右的蒸汽后再把安全阀关闭，这样可以使高压蒸汽锅里的压力迅速上升，原来沸腾的水因为压力的快速上升而停止沸腾，压力大，沸点高，水蒸汽就变成液体水，而放出大量的汽化潜热，就是高温高压的目的，从而达到杀菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；
二是湿热的穿透力比干热大；
三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否干净极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。要100度以上，也就是对应压力下的沸点后才能使水剧烈沸腾，将锅内空气更多的排除。
