质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)的应用！

质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)的应用！

一、背景

质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)不仅适用于常用的EndA-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也适用于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA+菌株中高丰度核酸酶的污染，并适用于从糖类修饰水平高的野生菌株中提取质粒。

质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

二、产品特点

1、离心吸附柱内硅基质膜特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2、快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

三、使用说明

1、取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。

2、每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀散开，无可见细菌团块。

3、每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌裂解，溶液透明。

4、每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

5、速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。

6、将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。

7、在质粒纯化柱内加入500微升溶液PB，速离心30-60秒，洗去核酸酶污染等杂质，倒弃收集管内液体。

8、在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

9、再速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇挥发。

10、将质粒纯化柱置于洁净1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。

11、速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。

四、应用

用于乳酸菌质粒提取方法及电转化条件的研究：

从发酵食品中乳酸菌的分离出发,进而从中提取高纯度的质粒,选择合适的质粒进行序列测定与分析,并对乳酸菌质粒与宿主的匹配能力进行研究。

从泡菜和酸奶中共分离得到8株乳酸菌菌株,其革兰氏染色均为阳性,无芽孢,接触酶检验为阴性,兼性厌氧,能够在5%的CO2条件下生长,代谢产物中有乳酸,能够将溴甲酚紫变成黄色,不产气,并能够耐盐生长。经16S rDNA鉴定,其中6株为植物乳杆菌,2株为嗜热链球菌。

对乳酸菌天然质粒的提取方法进行研究,发现与方法一（O’Sullivan等建立的方法）、方法二（乳酸菌的收集和裂解按O’Sullivan等建立的方法进行,质粒的抽提和回收按照大肠杆菌质粒提取方法进行）相比,采用方法三（菌体裂解前用溶菌酶处理,再使用北京TIANGEN质粒提取试剂盒进行质粒的提取）得到的质粒条带更为清晰、明亮,提取效果更好。对方法三作进一步优化,确定提取过程中溶菌酶的浓度为20mg/mL,处理时间为30min,同时避免了毒性物质溴化乙锭的使用。

分别从5株乳酸菌中进行了质粒的提取,并选择实验室从泡菜中分离的植物乳杆菌S1中提取的2 kb左右的质粒pLPS1作为研究对象,对pLPS1进行了测序,用生物信息学方法对其序列进行了分析研究。该质粒基因全长2117bp,G+C含量为38.03%。从2671448bp为开放阅读框ORF1,共编码393个氨基酸。编码蛋白质的理论分子量为44.3kDa。对编码蛋白质的二级结构进行预测,其中α-螺旋结构占总蛋白量的44.27%,延展链占7.38%,β-转角占4.58%,不规则卷曲占43.77%。蛋白序列的N端存在一个20个氨基酸左右的疏水区,经分析表明其具有信号肽功能。对质粒pMG36e的电转化条件进行了研究。

以植物乳杆菌CGMCC1.555为宿主菌,其转化条件为:工作电压2.25kV,甘氨酸浓度2.95%,培养时间3.96h,在此条件下,电转化效率达到预测值1909cfu/μg DNA;以乳酸乳球菌乳亚种CICC 6060为宿主菌时,电转化的条件为:工作电压2.38kV,甘氨酸浓度2.68%,培养时间6.19h,在此条件下,电转化效率达到预测值1375cfu/μg DNA。

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