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日常工作中，经常遇到老师咨询硅胶单体表面的硅烷键合方式，是单键键合、双键键合还是三键键和呢？填料表面是否有活性硅醇基，有没有封端？碳链上是否嵌入极性官能团，是哪种官能团？在有些项目标准上，要求固定相是碱基失活硅胶。熟悉固定相键合方式及其修饰，有助于了解色谱柱的使用条件，选择合适的色谱柱。

制备反相色谱柱填料常用的方法是有机硅烷和硅胶表面的硅醇基上发生共价反应，来“键合”生成固定相或者配合基R：

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）

HPLC柱子的制备可通过几种不同的硅烷-硅胶反应来实现。单体相是反相柱子里使用zui广泛的技术，即一个硅烷分子和硅醇基反应。这种一对一键合，使生成的键合相相对完善并且具有很好的重现性。这样制作的填料通常会具有zui高的柱效，因为固定相层相对不拥挤，因此溶质分子能够快速扩散进出固定相。相反，多官能团的、高度聚合的固定相则表现出较低的溶质扩散速度和较低的柱效，尤其是在流动相流速较高的情况下。

目前单体的硅烷-硅胶键合技术主要分为四种：单键键合（Ultimate^® XB-C18）、双键键合（Sunfire C18）、三键键合（Ultimate^® PAH）、双齿键合（ZORBAX Extend C18）。单键键合有利于提高传质速率，加快色谱柱平衡，但在低pH条件下长期使用时，单键键合相易流失，在色谱图上表现为保留时间缩短。而使用多键键合的方式（双键键合、三键键合和双齿键合）可以提高固定相在低pH条件下的稳定性。

因为存在结构位阻，硅胶表面的硅醇基无法wan全与硅烷分子键合，而残留的硅醇基，可能与碱性化合物发生次级离子交换作用，导致峰形不佳，因此常采用体积较小的TMS（如三甲基硅烷）或者其他技术封端，使填料表面尽可能的减小残留硅醇基。但是TMS在pH较低时容易被水解和破坏，这会造成保留时间和选择性发生改变。另一方面来说，封端填料提高了色谱柱在碱性条件下的稳定性，降低柱流失，并有利于色谱柱对极性和碱性化合物的分离、提供良好的峰形。

在硅胶表面的十八烷基的侧链上引入甲基、异丙基或异丁基，可以极大程度的屏蔽硅胶表面硅醇基的作用。空间保护对于低pH的分离实验非常有帮助，避免了低pH条件下O-Si键的断裂，但不能用在高pH条件下。具有空间保护功能的固定相可以以多种配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每个配合基在流动相较低的pH条件下均能保持较高的稳定性（pH低至0.8）。常见该类型色谱柱如月旭Ultimate^® LP系列色谱柱。

一般反相色谱柱对强极性和强碱性物质分离较差，在反相固定相的碳链中嵌入极性基团（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高对此类物质的选择性，同时极性基团屏蔽了硅胶表面的硅醇基作用，可极大改善峰形，在测定碱性物质时不拖尾。典型代表如采用酰胺基团的Ultimate^® Polar-RP色谱柱。

另外碳链中存在极性基团，能使固定相的亲水性湿润性增强，用到95%以上的高水流动相时，不会发生相塌陷。具有与普通的反相C18和C8柱不同的选择性，特别是对于酚类等极性物质。