CCK-8细胞活性检测实验步骤

  CCK-8实验可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。使用酶标仪在450nm波长处测OD值，可间接性反应活细胞的数量。使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测是一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
CCK-8细胞活性检测实验步骤：
一、实验前准备：
酒精灯、移液枪、酶标仪（带有450nm滤光片）、96孔培养板、CO2培养箱、CCK-8、细胞计数板、PBS等。
二、绘制曲线
1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ：按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度（比如，稀释10倍，100倍......），每组4-6个复孔。
3.绘制标准曲线：接种后培养一定时间待细胞贴壁后，然后每100μL培养基加10μL（10%）CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。
根据此标准曲线可测定出未知样品在条件一致的前提下的细胞数。
标准曲线还有助于确定细胞接种的合适数量以及摸索CCK-8后所需孵育时间。
三、细胞增殖检测

1.制备细胞悬液：选取生长状态良好的对数生长期细胞制作细胞悬液，并计数。
2.在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ：根据合适的铺板细胞数（根据自身的细胞类型而定，以一周能铺满为宜，若为血液细胞密度可适当增大），每孔接种约100ul细胞悬液，每组设置4-6个复孔。
①当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。悬浮细胞由于染色比较困难一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
②当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。为减少误差，最外一圈的孔只加100ul PBS、水或者培养液，不作为测定孔用。
③接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。3.将培养板置于培养箱中预培养（37℃，5% CO2）12-24小时，使细胞达到指数期（培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异）。
4.每孔加入10ul CCK-8试剂
①由于每孔加入CCK-8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议直接配置含10% CCK-8培养基（现用现配）以换液的形式加入。注意加CCK-8试剂时不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。加CCK-8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震培养板。
②加CCK-8试剂时间可分别在22h、46h、70h、94h时加入，也可以在24h、48h、72h、96h时再加入。重要的是需保证实验组和对照组在同一时间点进行实验。
③若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8。5.将培养板置于培养箱内继续培养0.5-4小时①培养时间因孔中细胞的类型和数量而异，需要自己摸索，因为细胞种类不同，形成Formazan的量也不一样。
②如果显色太浅的话，可以将96孔板置于37℃细胞培养箱中继续培养，可参考标准曲线确定培养时间。
③一般情况下，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（最多 4 h）或增加细胞数量。
④CCK-8 的反应时间以具体显色的适宜时间为准。可在0.5h、1.0h、2.0h分别观察培养基的颜色。最佳OD 值控制在1.0左右较合适。6.使用酶标仪检测450nm波长的吸光度（OD值）。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。

空白对照的设定：在同体积的培养基中加入CCK-8，培养同样的时间，和实验组一起测定450nm的吸光度。
①使用酶标仪检测时记得打开96孔板盖子，需保证酶标板的表面以及板底是干净的，且每个待测孔内没有气泡，以免干扰实验结果。
②如果结果出现“overflw”则需降低细胞接种密度，如果因实验需要不能减少细胞数时可缩短加入CCK-8后的培养时间。
③如果样品为高浑浊的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。（CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。）
④若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
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