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中药材中黄曲霉毒素检测解决方案
无锡冠一生物科技有限公司
2023/2/6 14:44:45
随着国家对生物毒素类污染残留的监管力度加大，各级实验室都面临着尽快建立切实可行的检测方法，在此就2020版药典《中国药典》编写了《中药材中黄曲霉毒素分析方法解决方案》，供中药材检测实验室人员参考查询。二、 2020版药典相比2015版药典检测黄曲霉方法变化解读三、 SN/T 4604-2016进出口中药材中真菌毒素的测定（节选）五、 Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪应用于药典中黄曲霉毒素测定
一、2020版药典2351黄曲霉毒素测定法
本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。4. ①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀释至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化温度70℃；②光化学柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.）5. 荧光检测器检测，激发波长：360nm(365nm) 发射波长：450nm精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0µg/mL、0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备溶液。精密量取储备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2min（搅拌速度大于11,000 r/min, 转速22,000 r/min）。3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（专用淋洗缓冲液）稀释至刻度，摇匀，离心10分钟（离心速度4000r/min）4. 准确移取20.0mL样品提取液，过免疫亲和柱，过柱时流速不能快，流速快的话回收效率差，建议采取重力过柱。5. 用水20mL洗脱（必要时可先用淋洗缓冲液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗涤液弃去。6. 为保证洗脱充分，建议以2.0mL色谱甲醇分三步进行洗脱，重力洗脱即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脱，当溶剂通过柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇进行洗脱，过柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脱，过柱前孵育30s，并使2-3mL空气通过柱体，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(免疫亲和柱操作建议使用泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率)7. 测定法：分别精密吸取上述混合对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。以十八烷基硅烷键硅胶填充剂；以10mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；柱温25℃；流速0.3mL/min；按下表中的规定进行梯度洗脱。
以三重四极杆串联质谱检测；喷雾离子源ESI)，采集模式为离子模式；各化合物监测离子对和撞压(CE)见下表。
精密量取黄曲霉毒素混对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0µg/mL、0.3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）适量，用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.04〜3ng/mL，黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.12〜l0ng/mL的系列对照品溶液，即得（必要时根据样品实际情况，制系列基质对照品溶液）测定法精密吸取上述系列对照品溶液各5μL,注入高效液相色谱-质谱，测定峰面积，以峰面积纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准。另精密吸取上述供试品溶液5μL，注入高效液相色谱-串联质谱，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1，或黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。精密量取 PriboFast®STD#1041黄曲霉毒素B1标准品溶液，PriboFast®STD#1082AFT黄曲霉毒素混合标准品溶液用硫酸盐缓冲液稀释成每1L含0 µg、0.05 µg、0.15 µg、0.45 µg、1.35 µg（测定黄曲霉毒素B1）或0 µg、0.025 µg、0.075 µg、0.225 µg、0.675 µg（测定黄曲霉毒素总量）的系列标准品溶液，即得。1. 供试品粉末2.0g至50mL离心管中，20mL甲醇振荡5min，离心5min（3000r/min）。2. 取2mL上清液至10mL干净离心管中，50-60℃水浴氮气流下吹干。3. 加入2mL去离子水振动30秒，加入6mL 振荡2min，离心5min（3000r/min）。4. 取下层 液3-10mL于离心管中，置氮吹仪于50-60℃水浴浓缩至干，加入1mL正己烷涡旋30秒，再加入2mL磷酸盐缓冲液涡旋1min，离心5min（3000r/min），取下层液，即得。黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素总量的测定：分别采用合适浓度的抗体包被微孔板孔，经封闭、干燥等处理后加入系列标准品溶液，再加入经酶标抗原稀释液稀释至合适工作浓度的酶标抗原，混匀，于25℃反应45min，用洗涤工作液洗涤，每孔加入底物显色液100μL，于25℃反应15min，每孔加入终止液50μL，采用酶标仪于450nm处，参比波长630nm，测定每孔吸光度值。（1）测定前，可选择阴性样本进行添加回收试验，样本回收率应在60%-120%。（3）供试品溶液百分吸光率超出标准曲线范围时，须对已制备好的供试品溶液进行稀释，使其百分吸光率落入曲线范围后再检测。1. 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。2. 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
二、2020版药典相比2015版药典检测黄曲霉方法变化解读
三、SN/T 4604-2016 进出口中药材中真菌毒素的测定（节选）
本标准规定了进出口中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。本标准适用于进出口当归、桔梗五味子、枸杞、大青叶、金银花、地龙中黄曲霉B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。称取5g试样(精确到0.01g)置于50 mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。称取5g试样(精确到0.01g)置于50 mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5 000 r/min离心10 min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。将免疫亲和柱连接于10 mL玻璃针筒下,将50 mL提取液B全部通过免疫亲和柱(PriboFast®复合免疫亲和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐温的PBS淋洗亲和柱，再将5mL提取液A通过免疫亲和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通过亲和柱，用5mL含0.1%吐温的PBS和20mL水淋洗亲和柱，直至空气进入亲和柱，弃去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，当甲醇大部分过柱时，停止加压，静置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；将淋洗液置于40℃下水浴氮气吹干，用1 mL甲醇-2 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(40：60体积比)溶解残渣，过0.22 μm有机系滤膜，用液相色谱-质谱/质谱测定。
四、复杂中药材样品测定解决方案
针对目前药典方法检测中药材中黄曲霉毒素过程中出现的决明子、远志、槟郎等个别样品基质复杂，净化效果差，谱图中杂质峰过多的问题，普瑞邦技术中心制定了一套针对中药材前处理的解决方案。应用此解决方案进行样品前处理，经高效液相色谱柱后光化学衍生进行检测可达到较好的净化效果，杂峰明显减少，使分析结果更加准确。供广大同行老师参考：
图1 方法优化后（左）与优化前（右）远志样品过柱对比
五、Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪应用于药典中黄曲霉毒素测定
通过Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在2015版药典中检测黄曲霉的案例，对比手工的精密度和回收率。全自动免疫亲和操作仪不但在具体的方法操作和技术运用上更加先进，而且在整个分析过程中都有非常严格的质量控制和质量保证，确保分析结果准确，排除人为操作造成的实验误差。
*注：上表采用远志样品，按照10μg/kg进行添加。
Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在进行过免疫亲和柱实验中得到了优于手动过柱的结果，通过比对不难发现，Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在回收率和精密度方面有所提高，大大节省了人力以及时间成本，同时也缩短了实验人员接触试剂的时间，保证了实验人员的安全。
