丙酮酸羧化酶是细胞质和线粒体代谢途径的重要元素，可以有效促进能量代谢。在 CHO 细胞中过表达酵母胞质丙酮酸羧化酶 (PYC2)，可 以增加丙酮酸流向 TCA 循环。增强的 PYC2 表达导致丙酮酸通量增加，从而使乳酸积累减少多达 4 倍，并显着增加细胞密度和培养寿命。有了这个结果，与亲本细胞相比，工程细胞的抗体表达显着提高了 70%，产品质量也有所提高（约 3 倍）。通过 PYC2 工程 改造提升细胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和细胞能量代谢方面具有均高于亲代细胞的各种优势。
PYC2 工程改造原理和方法
在补料分批上游工艺中，产生抗体的 CHO 细胞需要持续提供碳、氮、能量 (ATP) 和还原剂 (NADPH) 以维持其合成代谢功能。 由于培养基消耗糖酵解过程会产生乳酸和氨等不需要的废物，这些物质积累，会阻碍细胞生长以及重组产品的产品质量属性。
糖酵解是葡萄糖被氧化的主要分解代谢途径，最后，一分子葡萄糖转化为两分子丙酮酸，然后进入线粒体并在 TCA 循环中被氧化。CHO 细胞在补料分批模式下的细胞代谢需要高速率的糖酵解，从而触发丙酮酸的积累。由于线粒体和胞质代谢系统的连通性差，大部分积累的丙酮酸通量驱动乳酸脱氢酶 (LDH) 产生乳酸. 乳酸的测定一般使用EKF Biosen C-Line 来进行葡萄糖乳酸分析。
迄今为止，已经尝试了多种方法来使用生产宿主的代谢工程或细胞培养过程的过程工程来减少细胞培养废物。比如使用半乳糖或丙酮酸替代葡萄糖，或用天冬酰胺或谷氨酸替代谷氨酰胺。调节细胞系统代谢途径中涉及的酶来减少废物积累也是一种不错的选择。
PYC2 工程改造是通过在哺乳动物细胞 BHK 和 HEK293 细胞中表达胞质酵母丙酮酸羧化酶 2 (PYC2) 基因来减少乳酸积累，从而增加蛋白质产量或改善细胞生长， 实验证明，在 CHO 细胞中过表达 PYC2 可以延长细胞培养时间，并将乳酸/葡萄糖比率降低 25%，但是，比生产率降低 50%，从而影响整体体积抗体表达。主要方法是通过 PYC2 改造的细胞库的异源群体中筛选 PYC2 改造的 CHO 克隆。随后，根据培养性能及其代谢特征从 PYC2 克隆组中选择单细胞克隆。基于各种生化和代谢分析，建立了一个代谢控制的 CHO 平台，该平台具有增强的 PYC2 基因负载，并且能够在较高的细胞密度、高葡萄糖消耗率和降低的乳酸的分批补料过程中维持较长时间积累。
PYC2 工程的细胞库生成和细胞系开发
为了增强细胞代谢并改善细胞溶质和线粒体代谢途径，我们通过增加 CHO 细胞池中的 PYC2 基因负荷来改造 CHO 细胞系统。在这项研究中，我们使用密码子优化（针对 CHO）酵母丙酮酸羧化酶 (PYC2) 基因，该基因在 CHO 细胞的胞质溶胶中表达。PYC2 通过将细胞溶质丙酮酸驱向代谢途径的克雷伯循环，在控制丙酮酸积累方面发挥关键作用”。增加表达代谢优化 PYC2 基因的基因拷贝可有效触发丙酮酸流向线粒体代谢途径，并将糖酵解与 TCA 循环联系起来，以增强内部细胞能量代谢。
通过使用氖电穿孔法，用带有 PYC2 基因的质粒 pMPYC 转染 CHO-S 细胞（悬浮液），并产生稳定的细胞库。为了从转染池中筛选出所需的 CHO 克隆，我们应用了两阶段选择方案，其中我们使用不同浓度的选择剂嘌呤霉素和 MTX 生成了转染的 CHO 细胞群. 选择压力从低浓度逐渐增加到高浓度，通过消除源自高度异质性群体的不良细胞/克隆，可以严格选择所需的细胞库。选定的池具有混合的转染 PYC2-CHO 细胞群，这些细胞含有不同的 PYC2 基因拷贝，并且还由于随机整合事件以及 CHO 基因组中的位置效应而改变 PYC2 表达模式。为了评估每个池的代谢性能，我们进一步选择了池 1B、1C 和 2D 来评估 PYC2 表达效率，随后使用 CD-Forti-CHO 基础培养基和nest摇瓶进行了补料分批培养实验。实验中评估了代谢特征（乳酸和葡萄糖），细胞活力和生长模式从细胞周期的指数期到稳定期，并将几个重要参数与亲代 CHO 细胞（未转染）进行了比较。
实验结论
通过观察，pool 1B（选自 Phase I，含有 200nM MTX 和 20ug/ml Puromycin），pool 1C（选自 phase II，含有 500nM MTX 和 30ug/ml Puromycin）和 pool 2D（选自 phase II，含有1000nM MTX 和 50ug/ml Puromycin）在细胞活力和细胞密度分布方面显示出它们之间以及与亲代 CHO 细胞的显着差异。在池 1B 中，达到的峰值细胞密度高达 2000 万个细胞/mL，但是，细胞活力从第 10 天开始下降，并在第 14 天达到约 72%，而池 1C 显示细胞密度高达 2300 万个细胞/mL，并且活力从第 11 天开始下降，并在同一天（第 14 天）达到约 83%。相比之下，从最高浓度的选择剂中选出的 2D 池显示出显着延长的细胞活力以及池中最高的细胞密度（图 1B 和 1C）。在池 2D 中，达到的峰值细胞密度约为 2600 万个细胞/mL，第 14 天的细胞活力约为 92%，比包括亲代 CHO 细胞在内的其他两个池（图 1B 和 1C）高10-20 %，如上所述. 此外，我们分析了细胞在乳酸积累和消耗率方面的代谢行为，发现与其余池和亲代细胞相比，2D 池在乳酸代谢方面存在显着差异。池 2D 和 1C 以及池 1B 和亲代 CHO 细胞的乳酸谱彼此相似，但是，池 2D 的乳酸产量显着降低（图 1D）与其他细胞池相比。由于这些池具有不同 PYC2 基因负载的异质细胞群，并且在补料分批培养期间，异质群的累积效应显示细胞活力、密度和乳酸谱的变化，因此我们选择 2D 池作为后续池的最终池单细胞克隆、筛选和建立潜在的工程细胞候选者。单细胞分选是使用 Guava® Muse-细胞分析仪通过为活的和良好的边缘/边缘细胞形状设置有效门控来进行的（图 1E）。细胞分选在白色背景下进行，不使用任何标记试剂/抗体。分选的单细胞最初在 384 孔板中生长，并通过使用 ZenCELL innoME 活细胞动态成像分析仪在从第 0 天到第 17 天的不同时间间隔进一步监测它们的生长模式（图1F）。根据细胞/克隆的形态、生长和克隆性，我们挑出那些仅来源于单个细胞的菌落（通过细胞成像仪确认），然后将选定的菌落转移并从低体积逐渐扩大到高体积按照材料和方法（ 图 1E 和 1F）中的描述，进入多孔板，然后进入 T-25 烧瓶 . PYC2 克隆 #12 的克隆稳定性研究还在补充有 6mM 谷氨酰胺（摇瓶）的基础培养基 CD-Forti-CHO 中进行了 70 代，有和没有选择压力，发现稳定性长达 50 代。
苏州阿尔法提供CHO、HEK、Vero细胞、间充质干细胞、293T、RAW264.7细胞、H9C2细胞等百余种细胞系及培养基、胎牛血清、细胞培养套装等细胞培养试剂，同时提供细胞培养生物反应器、生物发酵罐、二氧化碳振荡培养箱、PCR仪、离心机、分光光度计、流式细胞分析仪、细胞计数仪、细胞显微成像系统和用于葡萄糖-乳酸分析的EKF Biosen C-Line 乳酸分析仪等，更多需求可进入苏州阿尔法生物实验器材有限公司了解。
