前言
拉曼光谱在复杂水体系中反映组分微小变化的能力深化了该技术在生物制药过程分析（如生物反应器中的细胞生长）方面的应用。拉曼光谱仪技术可以实时、原位和无损地监测生物制药生产过程，可用于复杂化学体系的连续过程监测。拉曼光谱技术在生物反应过程中可检测大量代谢物变化的能力已将该技术提升为强大的过程分析工具。
实验概述
拉曼光谱分析光学探头具有可重复使用的特点，通过减少运行间的可变性来提高过程监测的可重复性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 过程分析仪可匹配多个光纤探头。MarqMetrix 生物反应器球形探头是专为满足生物工艺工业的要求而设计的，可以搭载到 Ramina 过程分析仪上使用。这些探头具有快速、易于更换和连接以及耐用等特点，可以进行无菌处理，比如离线的高压灭菌。
DynaDrive 一次性生物反应器(S.U.B.)是 S.U.B. 技术的最新产品，为大规模生物生产提供了更好的性能，并具备可扩展性。与传统的 S.U.B. 设计相比，长方体的罐体具有几个关键优势，包括*的混合和传质能力以及更好的可扩展性。
本应用介绍了Ramina过程分析仪系统与 500L HyPerforma DynaDrive 生物反应器的集成，并实现关键过程参数(CPPs)的在线测量，通过采集整个细胞生长培养过程中连续生成的光谱数据建立起若干参数和代谢物的精确预测模型。
材料与方法
细胞培养和喂养策略
细胞培养在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中进行（见下图1），其中包含体积约为320L细胞培养基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的条件下接种0.5x106个细胞/mL。体系的 pH 值通过添加二氧化碳气体和碳酸钠来控制。
细胞在化学定义的培养基中生长，从第3天开始每天进行两步喂养过程。第一种喂养介质以起始体积的重量为4%添加，第二种喂养介质以0.4%添加。第6天体系温度转为33°C。试验在14天后终止。生物反应器避光处理以防止杂散光干扰。在高压灭菌后，将 Ramina 过程分析仪生物反应器球形探头插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，进行在线实时拉曼光谱数据采集。
图1.500L Thermo Scientific HyPerforma
DynaDrive S.U.B. 细胞培养罐
Ramina 过程分析仪测试
使用 Ramina 过程分析仪进行数据采集（见下图2）， Ramina 过程分析仪的生物反应器球形探头直接浸入在生物反应器(500L) 中，每平均20次测量获取一张拉曼光谱数据，积分/曝光时间为3秒，激光功率设置为450mW。每个数据光谱的总采集时间为2分钟，在 Ramina 过程分析仪用以建立模型数据与离线仪器分析通过匹配时间戳以确认。
图2.Thermo Scientific™ Ramina™
在线拉曼分析仪
化学计量学模型建立
来自多台 Ramina 过程分析仪、探头和生物反应器的数据被用于创建模型。训练数据集从每个生物反应器的45个样本中收集，以创建每个化学计量学模型。对光谱数据进行了检查，剔除了由宇宙射线引起的异常谱峰。选择感兴趣的光谱区域，并对光谱进行预处理，以去除基线干扰并优化信噪比。
建模过程中测试了许多预处理技术，包括Savitzky Golay滤波、自动Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根据建模的关注点选择优化不同的预处理技术。为每个感兴趣的组分创立偏最小二乘(PLS)模型并进行交叉验证以测试每个模型的优化的效果。这些组分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反应器培养过程中产生的常见代谢物。
结果
在这项工作中，在线拉曼光谱仪应用于连续分批补料 CHO 细胞培养过程。使用拉曼光谱监测工艺参数首先需要使用外部校准数据集（独立离线数据）建立化学计量学模型，通过对感兴趣的参数的离线分析数据和对应的在线拉曼光谱数据的关联关系建立模型。
为了评估 Ramina 过程分析仪预测值的准确性，每天收集生物反应器数据并进行分析比较。计算每个参数(RMSEP)的校准均方根误差(RMSEC)、交叉验证均方根误差 (RMSECV)和预测均方根误差。根据模型的预测计算平均误差，得到用于构建模型的 RMSECV。用模型未见过的“新”数据来测试模型，依据参数RMSEP判断。为每个 PLS 模型记录变异系数 R²。该值用于确定模型预测变量（X 变量）可以解释的 Y 变量的变化量。
值得一提的是，结合使用来自同一 CHO 培养过程的生物反应器运行的几个大型独立数据集，可以产生更准确和稳健的预测化学计量学模型。在这项研究中，来自之前生物反应器运行的五个独立数据集被组合起来训练一个大型化学计量学模型。然后将校准模型应用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反应器的预测。数据表明该模型能够准确预测这个新数据集，并且模型预测与离线收集的众多代谢物的数据测量高度相关，如下表1所示。
表1.模型预测值与离线数据的相关性
下图为赛默飞Hyperforma DynaDrive S.U.B.化学计量学模型预测——各重要参数的拉曼预测模型和离线数据对比。
结论
可重复使用MarqMetrix生物反应器BallProbe 探头具有TouchRaman浸没技术，连接Ramina过程分析仪，可对500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的关键过程参数葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及总细胞密度和活细胞密度进行准确的在线实时预测。相关性分析显示模型预测数据与离线分析数据之间具有良好的一致性，表明模型能稳健地应用于上表1中所示参数的预测。
