斑马鱼胚胎显微注射实验操作方法
显微注射技术是在显微镜下，利用显微操作系统，控制显微注射针在显微镜视野内移动，对进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。该技术已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项普遍的操作技术，并成功运用于包括小鼠、大鼠、兔子、斑马鱼及许多大型家畜，如牛、羊、猪等动物中。
斑马鱼显微注射是将实验材料直接注射到1-4细胞期的斑马鱼胚胎中，由于在这个胚胎发育早期没有膜分隔细胞和卵黄，注入1个细胞或卵黄的溶液将扩散到整个胚胎中。通过注射不同类型的实验样品，实现基因的瞬时过表达（over-expression）、表达敲减（knock-down）、以及制备转基因或突变斑马鱼品系等研究。
一、 胚胎显微注射技术的应用
斑马鱼作为一种新兴的理想的模式生物，在生命科学研究中已得到广泛应用，斑马鱼胚胎显微注射技术是这些应用研究的基础技术平台之一。通过显微注射不同的实验样品，可以实现以下不同的目的。
（一）可以通过注射体外合成的mRNA实现目的基因的过表达，并通过观察表型推测目的基因的功能。
（二）可以通过注射反义吗啉环寡核苷酸（morpholino）敲减目的基因的表达。morpholino是稳定的人工合成的核酸类似物，通过标准的碱基互补配对与mRNA结合，阻断蛋白翻译或mRNA剪切。与过表达相反，这种方法导致mRNA蛋白产物减少，可以通过该蛋白减少时对生物学过程的改变来解释目的基因在发育中所扮演的角色。
（三）基因敲除（knock-out）品系的研制。基因敲除品系是在活体动物上开展基因功能研究的重要工具。CRISPR-Cas9技术是一种高效、快速的构建敲除品系的新方法。这个技术的原理是通过人工设计出sgRNA，sgRNA能够通过碱基配对识别目标序列，然后引导体外合成的核酸内切酶Cas9蛋白在目标靶点产生切割。DNA断裂后，细胞将通过非同源末端接合(NHEJ)修复机制来进行修复，将断裂的DNA重新连接起来，在这个过程中会产生DNA碱基的插入或缺失的错误，从而引起DNA突变。
（四）转基因品系的研制。转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状产生可遗传的修饰。在转基因品系研制中，转基因载体是承载外源基因，携带靶基因进入斑马鱼胚胎细胞，并将目的基因整合到斑马鱼基因组使其稳定维持的DNA分子。显微注射是制备转基因斑马鱼过程中常用的方法。
二、 显微注射系统的搭建
斑马鱼显微注射需有一套相当精密的显微操作设备，主要包括以下几种（图4.1）：
图4.1显微注射常用设备。A: SUTTERP-1000微电极拉制仪; B: ASI显微注射仪MPPI-3;
C: 持针器和显微操作仪MM33; D：体视显微镜
微电极拉制仪用于拉制毛细管成注射针，可以调节的温度、拉力、拉制时间等参数拉制出合适针尖的注射针，为了防止空气中灰尘颗粒沾染注射针引起针尖阻塞，注射针现用现拉。
显微注射仪用于注射针内的溶液施加压力脉冲，利用可调节气压脉冲将精准体积的样品注射至胚胎体内。注射器还和一个脚踏板相连，使得实验人员在使用双手的同时还可以激活压力脉冲将实验材料注射入胚胎中；
持针器用于固定在注射过程中使用的注射针，并将它与注射器的空气管相连，常装在显微操作器上；
显微操作仪用于注射针的显微操纵，可以在显微注射过程中对注射针的位置进行细小和精准地调节；
体视显微镜用于显微注射时观察胚胎，可以在显微注射过程中看到胚胎并对注射针所在的位置聚焦。
三、 显微注射过程及注意事项
显微注射技术是一个相对精细的实验操作，主要有以下步骤。
（一）准备注射用的胚胎
注射的前1DAY，按照雌:雄为1:1或2 :1的比例将成年斑马鱼放置于配种缸，用隔板分开（图2.3）。
注射的早上，抽去隔板，雌雄鱼开始交配。一般在十多分钟左右亲鱼产卵并使卵受精。一般一次抽板2缸鱼左右，随后根据实验进度适时给其它缸抽板。可在抽板前先将内缸连同亲鱼换到另一干净外缸中以节约清洁胚胎的时间。
亲鱼产卵后，取180μm孔径的过滤网，收集外缸底部的鱼卵，并用养殖水清洗鱼卵2-3次。应尽量收集20 min内的受精卵（即对于同一缸亲鱼，两次收集受精卵的时间间隔不得超过20分钟，以保证发育阶段的一致性）。受精卵分选和洗净后，用吸管将收集的卵置于平板培养皿中，去除平皿内的异物和胚胎周围的水，采用干法注射。
胚胎在受精后10分钟卵膜将膨胀，随后数分钟内细胞形态变得较为规整（容易找到动物极），此时可以开始注射。受精后45分钟左右（标准培育温度下所需时间，具体情况同室温有关）发生一次卵裂。样品通常需要注射到1-4细胞时期胚胎，以下上样、断针、定量和注射都要在此段时间内或在此之前完成。
（二）拉针、上样和仪器准备工作
1、拉针。使用微电极拉制仪拉制一定数量的毛细管，应提前准备。
2、可以提前准备，样品通常包括质粒DNA、RNA、morpholino等。
DNA质粒样品：质粒DNA需使用“去内毒。素”的试剂盒提取。一般注射量为每枚胚胎20-150pg，多于200pg胚胎死亡率上升。
mRNA样品：一般注射量为每枚胚胎10-500pg，针对不同的mRNA样品，需要摸索各自适宜的浓度。
Morpholino样品：参见GeneTools公司随样品提供的说明书。通常产品总量为300nmol一瓶，约相当于2400μg，加入200μL灭过菌的去离子水（电阻率>18MΩ/cm）稀释至12μg/μL，每管20μL分装作为储液冻存在－20℃。注射时取一管稀释至0.5-6μg/μL (ng/nL)左右。针对不同的morpholino，需摸索各自合适的浓度，以获得理想的表型而不产生毒性效应为宜。在使用新的morpholino时，必须慎重考量该morpholino的有效性和特异性。
所有样品使用前需要先离心，使可能存在的固体悬浮物沉淀到管底，避免堵住针头。一般可以在注射样品中加入终浓度10%-20%的酚红，便于观察注射过程。
3、上样装针。将拉制好的毛细管竖直固定。然后吸取1-3μl显微注射液，逐滴地将注射液滴在毛细管顶端，在毛细管内芯引导下，液体通过虹吸作用将汇聚于玻璃管针头部分。如果使用的毛细管没有内芯，可以使用微量上样移液枪头上样。上样体积至少为1μL，一定不要在针内引入空气柱，否则会难以控制注射量。
4、打开显微注射仪。以MPPI-3脉冲压力注射仪为例。打开氮气罐总阀，调节压力至0-0.5之间。打开注射仪开关，调节主操作面板上的压力值为10-20左右，选择合适的注射压力和脉冲时间。（图4.2）
图4.2 全套搭建好的显微注射设备（左侧）和破针操作（右侧）
（三）注射斑马鱼胚胎
1、破针。将上好样品的注射针插入持针器中固定，然后在体视镜高倍放大率下，用尖头镊子将注射针的前端夹断。（图4.2）
2、注射剂量调整。把台微尺放置到体视显微镜下，加入一滴矿物油，将注射针伸入矿物油中，踩动踏板压将一滴注射液送到矿物油，测量注射样品的大小。注射体积与针尖大小、注射压力、注射时间、溶液粘度和外部压力有关，理想的注射剂量为胚胎体积的10%，一般为1nL（注射样品的直径在10个小格左右）。注射剂量过大体积会损伤胚胎，过小可能影响定量精准度和扩散的均匀程度。
3、注射。将收集的胚胎放置到体视显微镜镜下，用低倍物镜对准胚胎调焦，轻轻的落下针尖，并将注射针尖推入视野中心，通过微操作系统的微调调整注射针位置，直到清晰见到针尖为止。进一步调整显微镜焦距和注射针及胚胎的位置，使胚胎和注射针尖均达到非常清晰程度。推动操纵杆，小心进针，使注射针针尖进入胚胎。脚踏开关将样品注入胚胎。实验结束时，先关闭氮气罐总阀（逆时针变松为关），排空仪器中的气体后，关闭总开关。
（四）注射胚胎的培养和观察
1、胚胎养殖。注射结束后，将胚胎转移至养殖水中，置入28?C培养箱培养。待胚胎发育2小时后，显微镜下挑出未受精的胚胎和死亡的胚胎。孵化期间每天要及时去除败育胚胎，勤换水。
2、胚胎麻醉和固定。麻醉剂可以使鱼类代谢减缓，鳃动频率下降，氧的需求量减少，从而方便进行实验操作。通常将斑马鱼浸泡于0.016%的Tricaine中进行麻醉。待胚胎麻醉后，利用4%的甲基纤维素固定胚胎，将胚胎调整到合适的位置。废弃的显微注射针的尖儿端烧溶后可以用于调整胚胎。
3、胚胎观察。为了便于观察显微注射的结果，本次培训使用质粒pT2(tpma:EGFP)和chordin mopholino作为注射练习的材料。质粒pT2(tpma:EGFP)注射后，胚胎发育至1天时，在肌肉中特异表达绿色荧光蛋白；chordin mopholino注射后的胚胎出现腹部化（ventralization）。（图4.3）
图4.3 显微注射后24hpf胚胎的照片。胚胎发育至1天时，注射质粒pT2(tpma:EGFP)的胚胎在肌肉细胞中特异表达绿色荧光蛋白（A）；注射chordin mopholino的胚胎产生腹部化表型（B）。
显微注射的注意事项
显微注射的操作过程中有许多细节影响实验的成功率，需要特别关注，主要包括以下几方面。
1、注射样品的质量和和浓度。显微注射的样品种类繁多，包括mRNA、DNA或蛋白质等，但是注射样品是否纯净是关系到注射效率高低的重要因素之一。此外，注射样品的浓度不易太高，例如注射DNA的总浓度一般控制在200pg以下。
2、注射前小心将显微注射针定位，注射针定位到卵表面的注射角度是穿透坚硬的卵壳注射成功的关键。
3、破针时，将针尖一点点剪断，不宜一次剪太多。显微注射针尖如果太粗，会导致DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易堵塞针尖，而使DNA无法顺利流入，影响注射效率。因此进行显微注射时，如何制备适用的显微注射针是显微注射效率极其重要的因素。
4、在注射过程中，常发生注射针堵塞，堵塞后，通常可通过轻夹针尖、增大输出压力或按pulse/CONT开关而得以缓解。如果不能解决，换用新的注射针。
5、注射时注射器的压力不宜变化太快，否则会造成注射量操作难以控制，导致胚胎内环境改变过快过大甚至胀破细胞。氮气罐的压力阀显示气体的压力，压力为0表明罐内无气体，需要及时换气。
6、注射完毕，慢慢抽出注射针，要一气呵成，避免受精卵内物质随着毛细针抽出，造成受精卵的损伤。
7、在整个过程中，严禁将注射针尖对着人员和仪器，因为注射针在持针器上安装不牢时或针尖堵塞，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出伤人。
