由于CO2培养箱受使用环境和条件的影响较大，许多厂家在产品设计上仍保留用户重新校准的部件，一般是在面板上设有校准和调零微调。无论哪种类型的产品，校准工作都应在箱内的温度和湿度稳定之后进行。
1、温度校准：
有的产品在出厂前已完成温度校准工作，校准部件均安装在箱内的控制板上，用户不宜再作调整。对于面板上有校准微调的产品，可在接近培养温度下(如37℃)，取一根精密温度计置于箱内，待温度稳定后观察温度计指示值，如与显示值不跗，调整微调使其相附即可。
温度的校准步骤：
①在培养箱内放置一个准确的玻璃管式水银温度计，以校准所设定温度。同时，再放置一个准确的体温计，以校准极限温度。
②把温度旋钮调到所需温度37℃。
③把极限温度旋钮调到最大。等待24小时，让机器达到稳定。
④如果温度还没达到37℃，再调整温度旋钮到37℃，然后再等待24小时，让机器最后达到稳定。
⑤当培养箱稳定在37℃后，按逆时针方向转动极限温度旋钮，直到该极限温度旋钮的指示灯明亮为止。
⑥再小心地把极限温度旋钮顺时针方向转动，直到指示灯刚好熄灭为止。
注意:机器正常运转期间，其极限温度指示灯应保持熄灭状态。当箱内温度高于极限温度时，该指示灯点亮报警。如果面板液晶显示温度与箱内温度计读数不符，可进一步调整校准。首先，调整显示器点，直到读数与水银温度计的读数相吻合，然后，等待数小时，让机器稳定。如果还不相符，可重复上一步骤，直到机器达到最终稳定。
2、CO2浓度校准：
先进行零点校准。在CO2培养箱的气体条件中，一般是以空气中的CO2浓度为零点的，故在箱内充满新鲜空气时的显示值应为0。校准时先断开气源，打开箱门数分钟后再关闭，待温、湿度稳定后两整调零微调使显示值为0。
CO2浓度校准一般采用气体分析法和标准气体法两种方法。前者是通过面板上的气体采样孔采取箱内气体样品，经分析获得CO2实际浓度，再校正显示值;后者是将已知CO2浓度的标准气体充人箱内，再校正显示值。
对比之下，气体分析法成本较低，但需具备气体分析条件或进有关部门检验;标准气体法较为方便，但购买标准气价格较贵。校准时应注意，零点校准与浓度枝准相互有一定影响，所以这两项校准应反复进行至少三次。
