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齐英姿
Literature sharing
本次我们分享两篇文章，分别于2022年09月和2022年10月发表于bioRxiv [1-2]，文章内容为在单细胞蛋白质组学领域，使用基于PD3.0_CHIMERYS检索及质谱宽隔离窗口采集的方法，搭配全新的μPAC 色谱柱的赛默飞综合解决方案，提升单细胞蛋白质鉴定的性能。接下来我们分别进行具体的介绍。
基于DDA采集模式与单细胞组学的低离子数目的特点，采用更大的隔离窗口，增加共隔离的离子数目，这是一种被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的采集方法，文献中将这个方法称之为宽隔离窗口采集（wide window acquisition ,WWA)策略(如图1所示)。
图1：wide window acquisition (WWA)宽隔离窗口采集策略（点击查看大图）
PD软件3.0版本自2022年年中发布以来，其对DDA蛋白质组学数据的性能提升有目共睹；如需CHIMERYS的介绍，可具体参考以下链接
《好风凭借力：CHIMERYS实现蛋白质组学数据的性能飞跃》
——赛默飞orbitrap组学俱乐部公众号
点击图片可查看
基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，可在一张二级谱图中解析出多个PSMs，擅长于解析WWA采集得到的更加复杂的二级谱图。
作为 LC-MS/MS的重要组成部分的低流速液相色谱，对减少样品的复杂度、增加蛋白质组学的鉴定方面的贡献尤为重要，通常我们可以通过拉长色谱梯度等方法来实现更好的分离，而这也会引入包括峰展宽在内的灵敏度的降低及检测通量的降低等问题。而新发布的微柱蚀刻技术的μPAC系列色谱柱，具有高度有序的排列，有助于更加优异的峰宽表现且减小柱残留，低背压的设计也使其可以使用更大的流速，可以更快的上样、清洗及平衡色谱柱，从而增加检测通量(赛默飞提供的综合解决方案如图2所示)。
图2：结合了低流速液相色谱、质谱及分析软件的完整综合解决方案（点击查看大图）
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不同的色谱柱性能比较
在色谱柱的比较中，与传统的填充柱相比，作者对比了110cm的第二代μPAC色谱柱与其他两款填充型色谱柱(50cm及25cm)，如图3所示，上样量为12.5ng Hela肽段，30min有效梯度，采用1Th的采集窗口，第二代μPAC色谱柱可以得到蛋白水平66%和肽段水平140%的提升。
而比较不同的μPAC色谱柱（5.5cm原型柱、50cm Neo柱和110cm二代柱），使用复杂样品(HeLa, yeast, 和 E. coli按照8:1:1混样)，10ng-400ng的上样区间，蛋白鉴定结果如图3所示。50cm的Neo色谱柱，在30min及60min梯度上具有优异的表现，特别是在低上样量的条件下。我们需要的样品的通量(梯度时间)及样品的复杂度则决定了WWA方法对单细胞样品的适用性，样品通量是单细胞蛋白组学领域的重要关注点，使用5.5cm色谱柱搭配高流速，可实现到~100spd的水平。
图3：不同的色谱柱性能比较
（点击查看大图）
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隔离窗口的优化
在WWA方法中，若使用了＞4m/z的较宽的母离子隔离窗口，使得临近的母离子被共同碎裂，这时二级谱图会形成类似于DIA采集方法的混合谱，这种方法不仅能增加鉴定数，还能提高鉴定时对低丰度肽段的灵敏度；对不同大小的隔离窗口进行优化，在250pg到400ng的上样区间中，可以看到，更宽的隔离窗口更适合较小上样量的结果，如250pg和1ng的上样量下，隔离窗口12m/z和8m/z为最适效果。搭配于CHIMERYS的检索方法，更大的隔离窗口所提供的谱图复杂度，使得对低丰度肽段有更好的挖掘，拓宽了鉴定的丰度的动态范围。
图4：不同上样量条件下隔离窗口的优化
（点击查看大图）
在质谱方法中，单细胞的样品由于离子数更少，往往需要更高的最大离子注入时间，比如几百个毫秒，这会导致二级谱图数的降低，从而显著的影响鉴定量。此时我们也可以配合使用更高的分辨率，可以识别更加复杂的离子，也就是说，我们可以使用更大的隔离窗口来提供更多的离子进行累积，并且通过高分辨率来识别这些离子，而后我们可以通过PD3.0 CHIMERYS引擎来对这些复杂的混合谱图进行检索。
使用经典的窄隔离窗口采集方法，与传统的MS Amanda 2.0 引擎相比，CHIMERYS引擎可提升鉴定量2.6倍；而再加成上宽隔离窗口的WWA采集方法后，则可达到4.6倍的提升水平。
图5：CHIMERYS搜索引擎提升蛋白质组学鉴定深度
（点击查看大图）
另一篇文献中，作者使用0.2ng Hela肽段，对不同的隔离窗口、最大离子注入时间、分辨率等参数进行优化，发现在MS2分辨率为45k和60k时，我们能够得到最多的PSMs鉴定数。在隔离窗口为8或者12Th时，会得到最好的结果。0.2ng Hela的上样量，WWA模式可达到2,396个蛋白鉴定，比普通DDA模式鉴定量增加39%。
图5：采用0.2ngHela肽段及40min对WWA模式质谱采集参数进行优化（点击查看大图）
在短梯度模式下，峰容量降低，使其谱图的复杂度更高。基于CHIMERYS的破解高度复杂的混合谱的能力，使得更快的色谱分析成为可能。在使用12Th的隔离窗口与60k MS2分辨率的组合条件下，可得到最好的鉴定能力。使用此参数组合，更快的20min的鉴定量仅比40min少了10%（3160 vs 3524）。这说明，在并未显著影响蛋白质组学鉴定量的条件下，WWA的采集方法适用于更快速的梯度分离。
由于WWA采集方法被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的方式，故文章对不同的采集模式进行了比较；在单细胞水平的比较中（10个Hela细胞及7-10个K562细胞），使用相同的118ms和60K分辨率的二级参数，定性深度的比较中，WWA采集方法可得到最多的鉴定。
图6：不同的采集模式（DIA, DDA 及 WWA）比较
（点击查看大图）
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结语
WWA采集方案的提出，为我们进行快速的、更高深度的单细胞蛋白质组学提供了新的思路：基于赛默飞综合解决方案，我们从全新的Vanquish neo低流速液相色谱、μPAC色谱柱、宽隔离窗口的质谱采集策略以及全新的基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，全方面提升单细胞蛋白质组学鉴定深度。
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