石蜡切片的酶免疫组化注意事项

一. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？

一般来说，如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话，如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法：

1.一般用APES：丙酮=1:50的处理液来处理片子，处理5min左右，然后水洗，烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上，水比较聚的话说明片子处理的好。

2.贴片子的时候，展片的时间要把握好，不要太长，否则不利于贴牢。

3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要马上收起来，而是水平至于烘片台上37度两个小时以上，一是水分彻di烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。

4.再补充一点 ，石蜡包埋时，酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分，这对贴片也有影响。

如果这些导致掉片的因素都已经排除但是片子还是掉的厉害，那么也可能是以下原因造成的：

1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。

2、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

3、组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

4、没烤好，时间短温度不够之类。

5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

6、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

二. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？

着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：

1.切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。

2.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。

3.如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

三. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体 试试。

b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。

c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。

全片着色

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会 游离出 氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到 理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组 化染 色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太 长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

四. 免疫组化结果老是出现阴性结果？

免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。

五. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？

1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

六. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。

关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果 来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加 热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖 上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。

我们用的微波修复条件为：

2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调ph值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。

七. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？

用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的，一是因为石蜡切片比较薄，另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏，所以这一步可以省略。

八. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？

复染时间不需要太长，当然这也要根据苏木精的质量来确定，但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量浓盐酸）分色，分色的另 外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合，这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度，分色这一步最好不要省掉。分色后记得再 用氨水返蓝一下。