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给您一双鉴别支原体污染的慧眼

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2023/4/3 17:18:44

很多小伙伴都疑惑,细胞被支原体污染后的特征是什么?如何鉴别细胞被支原体污染了?今天,我带大家分享两个支原体污染的案例,共同探寻一下细胞被支原体污染后的特征。


图1 感染支原体的EBTr(牛胚气管细胞)

 

先来观察一下被支原体污染的牛胚气管细胞(图1),由成纤维样逐渐变得类上皮样;质膜铺展,溃烂;轮廓不清,边界模糊。再看右图,细胞处于边增殖边凋亡的状态,漂浮凋亡细胞过多。


图2 感染支原体的HT1080(人纤维肉瘤细胞)

 

接下来再观察一下被支原体污染的人纤维肉瘤细胞HT1080(图2),由上皮样逐渐变得类成纤维样,胞体细长,和前面的牛胚气管细胞形态变化刚好相反;伪足伸长,出现明显的拉丝现象,表明细胞可能在“痛苦”地迁移。使用了支原体杀除试剂(abs9375),清除了支原体以后,如右图所示,细胞逐渐恢复了上皮样形态,拉丝减少。


图3 细胞膜上的支原体集落

 

接下来,给大家展示贴附在细胞膜上的支原体集落(图3),支原体是目前已知最小的原核生物,直径大小在0.1-0.3um,比细菌还要小。支原体可在培养液、细胞膜、细胞内增殖。单个支原体需要借助于电镜才可以观察到具体形态,图中膜上的黑点为支原体集落。细胞背景干净,形态没有大的变化,但质膜粗糙,布满黑点。

总结下来,细胞被支原体污染的主要特征如下:

✔ 增殖减慢;

✔ 上清液澄澈;

✔ 背景干净;

✔ 细胞形态异常(拉丝、铺展);

✔ 更换新的培养液细胞状态没有恢复。

 

细胞被支原体污染后的共性表现为细胞增殖减慢、上清液澄澈、背景干净,这3点可以明确地排除真、细菌污染。值得一提的是,当给细胞的营养体系不佳时,细胞也会表现出形态异常,所以,我们可以给细胞更换新的培养液,如果细胞也没有恢复正常形态,此时判断细胞极有可能被支原体“附身”了。

上述的判断方法需要丰富的经验积累,日常细胞培养中,我们还可以用PCR扩增试剂盒检测细胞是否有支原体污染。


图4 支原体检测试剂盒(PCR法)

产品优势:

✔ 本试剂盒检测灵敏度高,可检测低至20个拷贝的支原体

✔ 实验时间短,3小时即可完成

✔ 已在多个支原体品种上做过验证。


表1 产品组分表

组分名称规格
AMycoplasma PCR Mix(2x)1ml
BMycoplasma Primer Mix100ul
CPositive Control50ul
DMycoplasma Free Water1ml


该试剂盒检测到的支原体类别主要有:

M.fermentans(发酵支原体)、M.hyorhinis(猪鼻支原体)、M.arginini(精氨酸支原体)、M. Orale(口腔支原体)、M.hominis(人型支原体)、M.bovis(牛支原体)、M.pneumoniae(肺炎支原体)、M.pirum(梨支原体)、M.gallisepticum(鸡毒支原体)、Ureaplasma spp(解脲支原体)、A.laidlawii(莱氏无胆甾原体) 等11种以上支原体。

作用原理:

试剂盒使用的混合引物是针对支原体16s rRNA序列的保守区域设计的特异性引物,可直接使用细胞培养液作为PCR模板,特异性扩增支原体DNA。

支原体检测试剂盒(PCR法)使用方法

1、样品准备

取适量待检细胞培养上清于洁净的PCR管中(如果是血清样本,可用 Mycoplasma Free Water 稀释),利用PCR仪95℃热处理5min后作为模板;

2、PCR体系配制

每次实验需设置阴性对照(将1μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water)与阳性对照(在1μL待检样品中加入0.5μL Positive Control后一起作为Template),实验时戴一次性口罩与手套,谨慎操作,防止操作不当引入外源支原体污染;

3、PCR程序设置


表2


StepTemperatureTimeCycles
Initial Denaturation98℃2 min1
Denaturation98℃20S 
Annealing56℃25S30
Extension72℃10S 
Final extension72℃5min1
Hold4-16℃Forever 












4、凝胶电泳

取10μL PCR产物,使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测;

5、结果分析

每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况,阳性条带大小500bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是PCR体系中出现污染,建议重新实验确认结果。如有必要,也可对PCR产物进行常规测序,以确定具体的支原体种属。

如果您的细胞真的“中镖”了,也不要怕,我们的支原体杀除试剂为您的细胞披荆斩棘,保驾护航。


图5 支原体清除剂(abs9375-200uL×5)


产品优势:

✔ 特异性清除培养基中的支原体;

✔ 只需要3-6天,便可以有效清除支原体;

✔ 活性成分为多肽类,不会产生耐药性;

✔ 对细胞几乎无毒性,在100多种细胞上进行过验证,包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等;

✔ 广谱性,可替代双抗,可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌;

✔ 可直接加入血清、培养基中,用于清除支原体污染;

使用方法:
1、收到货后,将试剂管瞬时离心(3000rpm,3~5s)保存。
2、推荐稀释比例为1:1000。例如10mL的培养基加入10μL的Treatment混匀。

3、弃去旧的培养基,用PBS将细胞清洗干净,再加入含有支原体清除剂的新鲜培养基,1天1次, 连续处理3天;或者2天1次,连续处理5~6天。若细胞污染非常严重时,需延长处理时间。
4、若细胞对支原体清除剂敏感,或生长明显被抑制时,请参考以下推荐参数。


表3

 大部分细胞部分敏感细胞少部分极敏感细胞
稀释比例1:10001:20001:3000
处理时间3天6天10天

 




5、处理完毕后,加入新鲜培养基,培养基中可添加支原体预防剂(abs9376)预防支原体再次污染。

 

本期讲解就到这里了,如有细胞培养问题,欢迎微信公众号后台留言,或者扫描下方二维码加入我们微信群交流~


注:图源网络和客户,仅供参考学习用

 

表4 细胞培养类产品推荐

货号

品名

规格

abs981

胎牛血清(特级)

500ml

abs972

胎牛血清(优级)

500ml

abs974

胎牛血清(标准级)

500ml

abs9483

高糖DMEM培养基

500ml

abs9484

RPMI-1640培养基

500ml

abs9505

MEM培养基

500ml

abs9506

α-MEM培养基

500ml

abs9554

Ham's F-12培养基

500ml

abs9563

Ham's F-12K培养基

500ml

abs9561

DMEM/F-12培养基

500ml

abs962

PBS缓冲液

500ml

abs970

D-PBS缓冲液(不含 Ca2+ Mg2+

500ml

abs971

D-PBS缓冲液(含 Ca2+ Mg2+)

500ml

abs9257

Hanks平衡盐溶液(不含 Ca2+ Mg2+)

500ml

abs9258

Hanks平衡盐溶液(含 Ca2+ Mg2+)

500ml

abs47014938

胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) ,含酚红

100ml

abs47047375

胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%),不含酚红

100mL

abs9479

无DMSO无血清细胞冻存液

100mL

abs9417

无血清细胞冻存液

100mL

abs9473

细胞冻存液(含血清)

100mL

abs9474

组织保存液

100ml

abs9480

组织冻存试剂盒

30ml

abs9486

模具

1个/套

abs9487

小刀

5片/包

abs9481

组织复苏试剂盒

50ml

abs42020125

卡那霉素B硫酸盐

250mg

abs42018967

硫酸庆大霉素溶液

10ml

abs9244

青链双抗

100ml

abs9245

青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液

100ml

abs42013298

两性霉素B

1g

abs44071148

制霉菌素

1g

abs9246

青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液

100ml

abs9252

支原体检测试剂盒

100T

abs9375

支原体清除试剂

200uL×5

abs9376

支原体预防

500uL×4

abs816578

环丙沙星盐酸盐

500mg

abs9374

水盘抑菌剂

20ml

abs9371

水浴锅抑菌剂

100ml

abs9372

培养箱除菌剂

480ml

abs9373

细胞房除菌剂

480ml


Absin特色产品线:

WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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