很多小伙伴都疑惑，细胞被支原体污染后的特征是什么？如何鉴别细胞被支原体污染了？今天，我带大家分享两个支原体污染的案例，共同探寻一下细胞被支原体污染后的特征。
图1 感染支原体的EBTr（牛胚气管细胞）
先来观察一下被支原体污染的牛胚气管细胞（图1），由成纤维样逐渐变得类上皮样；质膜铺展，溃烂；轮廓不清，边界模糊。再看右图，细胞处于边增殖边凋亡的状态，漂浮凋亡细胞过多。
图2 感染支原体的HT1080（人纤维肉瘤细胞）
接下来再观察一下被支原体污染的人纤维肉瘤细胞HT1080（图2），由上皮样逐渐变得类成纤维样，胞体细长，和前面的牛胚气管细胞形态变化刚好相反；伪足伸长，出现明显的拉丝现象，表明细胞可能在“痛苦”地迁移。使用了支原体杀除试剂（abs9375），清除了支原体以后，如右图所示，细胞逐渐恢复了上皮样形态，拉丝减少。
图3 细胞膜上的支原体集落
接下来，给大家展示贴附在细胞膜上的支原体集落（图3），支原体是目前已知最小的原核生物，直径大小在0.1-0.3um，比细菌还要小。支原体可在培养液、细胞膜、细胞内增殖。单个支原体需要借助于电镜才可以观察到具体形态，图中膜上的黑点为支原体集落。细胞背景干净，形态没有大的变化，但质膜粗糙，布满黑点。
总结下来，细胞被支原体污染的主要特征如下：
✔ 增殖减慢；
✔ 上清液澄澈；
✔ 背景干净；
✔ 细胞形态异常（拉丝、铺展）；
✔ 更换新的培养液细胞状态没有恢复。
细胞被支原体污染后的共性表现为细胞增殖减慢、上清液澄澈、背景干净，这3点可以明确地排除真、细菌污染。值得一提的是，当给细胞的营养体系不佳时，细胞也会表现出形态异常，所以，我们可以给细胞更换新的培养液，如果细胞也没有恢复正常形态，此时判断细胞极有可能被支原体“附身”了。
上述的判断方法需要丰富的经验积累，日常细胞培养中，我们还可以用PCR扩增试剂盒检测细胞是否有支原体污染。
 图4 支原体检测试剂盒（PCR法） | 产品优势： ✔ 本试剂盒检测灵敏度高，可检测低至20个拷贝的支原体； ✔ 实验时间短，3小时即可完成； ✔ 已在多个支原体品种上做过验证。 |
表1 产品组分表
| 组分 | 名称 | 规格 |
| A | Mycoplasma PCR Mix（2x） | 1ml |
| B | Mycoplasma Primer Mix | 100ul |
| C | Positive Control | 50ul |
| D | Mycoplasma Free Water | 1ml |
该试剂盒检测到的支原体类别主要有：
M.fermentans（发酵支原体）、M.hyorhinis（猪鼻支原体）、M.arginini（精氨酸支原体）、M. Orale（口腔支原体）、M.hominis（人型支原体）、M.bovis（牛支原体）、M.pneumoniae（肺炎支原体）、M.pirum（梨支原体）、M.gallisepticum（鸡毒支原体）、Ureaplasma spp（解脲支原体）、A.laidlawii（莱氏无胆甾原体） 等11种以上支原体。
作用原理：
试剂盒使用的混合引物是针对支原体16s rRNA序列的保守区域设计的特异性引物，可直接使用细胞培养液作为PCR模板，特异性扩增支原体DNA。
支原体检测试剂盒（PCR法）使用方法
1、样品准备
取适量待检细胞培养上清于洁净的PCR管中（如果是血清样本，可用 Mycoplasma Free Water 稀释），利用PCR仪95℃热处理5min后作为模板；
2、PCR体系配制
每次实验需设置阴性对照（将1μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water）与阳性对照（在1μL待检样品中加入0.5μL Positive Control后一起作为Template），实验时戴一次性口罩与手套，谨慎操作，防止操作不当引入外源支原体污染；
3、PCR程序设置
表2
| Step | Temperature | Time | Cycles |
| Initial Denaturation | 98℃ | 2 min | 1 |
| Denaturation | 98℃ | 20S | |
| Annealing | 56℃ | 25S | 30 |
| Extension | 72℃ | 10S | |
| Final extension | 72℃ | 5min | 1 |
| Hold | 4-16℃ | Forever |
4、凝胶电泳
取10μL PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；
5、结果分析
每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况，阳性条带大小500bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是PCR体系中出现污染，建议重新实验确认结果。如有必要，也可对PCR产物进行常规测序，以确定具体的支原体种属。
如果您的细胞真的“中镖”了，也不要怕，我们的支原体杀除试剂为您的细胞披荆斩棘，保驾护航。
产品优势：
✔ 特异性清除培养基中的支原体；
✔ 只需要3-6天，便可以有效清除支原体；
✔ 活性成分为多肽类，不会产生耐药性；
✔ 对细胞几乎无毒性，在100多种细胞上进行过验证，包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；
✔ 广谱性，可替代双抗，可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌；
✔ 可直接加入血清、培养基中，用于清除支原体污染；
使用方法：
1、收到货后，将试剂管瞬时离心（3000rpm，3～5s）保存。
2、推荐稀释比例为1:1000。例如10mL的培养基加入10μL的Treatment混匀。
3、弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入含有支原体清除剂的新鲜培养基，1天1次， 连续处理3天；或者2天1次，连续处理5～6天。若细胞污染非常严重时，需延长处理时间。
4、若细胞对支原体清除剂敏感，或生长明显被抑制时，请参考以下推荐参数。
表3
| 大部分细胞 | 部分敏感细胞 | 少部分极敏感细胞 | |
| 稀释比例 | 1：1000 | 1：2000 | 1：3000 |
| 处理时间 | 3天 | 6天 | 10天 |
5、处理完毕后，加入新鲜培养基，培养基中可添加支原体预防剂（abs9376）预防支原体再次污染。
本期讲解就到这里了，如有细胞培养问题，欢迎微信公众号后台留言，或者扫描下方二维码加入我们微信群交流~
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表4 细胞培养类产品推荐
货号 | 品名 | 规格 |
abs981 | 胎牛血清（特级） | 500ml |
abs972 | 胎牛血清（优级） | 500ml |
abs974 | 胎牛血清（标准级） | 500ml |
abs9483 | 高糖DMEM培养基 | 500ml |
abs9484 | RPMI-1640培养基 | 500ml |
abs9505 | MEM培养基 | 500ml |
abs9506 | α-MEM培养基 | 500ml |
abs9554 | Ham's F-12培养基 | 500ml |
abs9563 | Ham's F-12K培养基 | 500ml |
abs9561 | DMEM/F-12培养基 | 500ml |
abs962 | PBS缓冲液 | 500ml |
abs970 | D-PBS缓冲液（不含 Ca2+ Mg2+） | 500ml |
abs971 | D-PBS缓冲液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9257 | Hanks平衡盐溶液（不含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs9258 | Hanks平衡盐溶液（含 Ca2+ Mg2+) | 500ml |
abs47014938 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） ，含酚红 | 100ml |
abs47047375 | 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），不含酚红 | 100mL |
abs9479 | 无DMSO无血清细胞冻存液 | 100mL |
abs9417 | 无血清细胞冻存液 | 100mL |
abs9473 | 细胞冻存液（含血清） | 100mL |
abs9474 | 组织保存液 | 100ml |
abs9480 | 组织冻存试剂盒 | 30ml |
abs9486 | 模具 | 1个/套 |
abs9487 | 小刀 | 5片/包 |
abs9481 | 组织复苏试剂盒 | 50ml |
abs42020125 | 卡那霉素B硫酸盐 | 250mg |
abs42018967 | 硫酸庆大霉素溶液 | 10ml |
abs9244 | 青链双抗 | 100ml |
abs9245 | 青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液 | 100ml |
abs42013298 | 两性霉素B | 1g |
abs44071148 | 制霉菌素 | 1g |
abs9246 | 青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液 | 100ml |
abs9252 | 支原体检测试剂盒 | 100T |
abs9375 | 支原体清除试剂 | 200uL×5 |
abs9376 | 支原体预防 | 500uL×4 |
abs816578 | 环丙沙星盐酸盐 | 500mg |
abs9374 | 水盘抑菌剂 | 20ml |
abs9371 | 水浴锅抑菌剂 | 100ml |
abs9372 | 培养箱除菌剂 | 480ml |
abs9373 | 细胞房除菌剂 | 480ml |
Absin特色产品线：
WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
