概述
香兰素（图 1）是天然香草的主要成分，是世界范围内使用非常广泛和非常重要的调味材料之一。
香兰素可以从热带香草兰(主要是 Vanilla planifolia Andrews) ¹的豆子或豆荚中提取、重组生产或合成。食品配方中使用的纯香兰素的来源可以通过其同位素特征²来区分。该方法可能需要先进行初步纯化。
在本研究中，使用香草的乙醇粗提物来对比VERITY® PLC 2050 系统与不同类型色谱柱配合使用的能力。在 HPLC 制备柱和 CPC PRO 上进行香兰素（Vanillin）的制备纯化。对比了两种技术所获取最终的香兰素纯度、溶剂消耗和进样量。
离心分配色谱技术是什么？
它全称Centrifugal Partition Chromatography, 由Nunogaki发明，简称CPC。CPC属于现代逆流色谱技术的一种，它和滴流逆流色谱（DCCC）、旋转腔式逆流色谱（RLCCC）以及回旋腔室逆流色谱（GLCCC）等同属于非螺旋管式的逆流色谱。
离心分配色谱技术的原理
和以硅胶颗粒等材质作为固定相以及有机溶剂作为流动相的传统HPLC色谱有所不同，离心分配色谱技术的原理和液液萃取相似，都是利用待分离物质在两种互不相溶的有机溶剂中不同的溶解度作为基础，将其中一种溶剂作为固定相，另外一种作为流动相。
离心分配色谱的技术优点
离心分配色谱技术和利用色谱柱的制备色谱相比，其使用成本更低。最大的优点就是为用户节省了色谱柱这个耗材，CPC利用的是不锈钢旋转式分离柱，不需要频繁的更换。CPC技术在对有机溶剂的消耗量上也更为节省，在分离过程中不需要使用大量的流动相来冲洗色谱柱。
由于不使用硅胶颗粒这类较为脆弱的分离介质，当科学家采用离心分配色谱仪进行目标物的制备纯化时，待分离的产物无需经过前处理就可以直接进样。
CPC技术可以兼容多肽和蛋白质的分离，没有样品损失，坚实耐用，可以直接从实验方法向工业分离进化。
离心分配色谱(CPC)应用的优势
• 可从 6.3 g 粗提物获得 500 mg 的纯香兰素，并进一步同位素分析确认其特性。
• 制备型高效液相色谱法与离心分离色谱法在香兰素纯化方面的比较。
解决的问题
• 一套制备型液相系统 (PLC 2050) 可以同时适应制备高效液相色谱法和离心分离色谱法。
• 与制备高效液相色谱相比，离心分离色谱(CPC 250 PRO) 是复杂提取物处理的更佳选择。
• 大幅度减少溶剂消耗，降低成本和对环境的影响
材料和方法
01.系统
纯化仪器
图 2 搭载离心分离色谱仪(左)的 PLC 纯化系统 (右)
图 3 装载制备液相色谱柱的 PLC 2050
Gilson VERITY CPC 250 Pro 离心分配色谱仪(图2)， 或者 Merck 公司的制备 HPLC 色谱柱 Hibar 250 X25, C18, 5μm (图3) 连接到 Gilson PLC 2050 系统, 该系统配有一台 50 mL/min 的四元梯度泵，一台紫外检测器, 一台馏分收集器及配套的 Gilson Glider 软件。
分析仪器
配备波长范围200-800nm二极管阵列检测器 (PDA)的HPLC系统
02.样品
表1 HPLC分析条件
图 4 粗提物在280nm的HPLC分析色谱图
通过外标对照品校正， 粗提物种中香兰素的含量约为 9% (w/w) 。提取物中大部分的分子没有被紫外检测到。
制备 28 g/L 的香兰素提取物溶液用于离心分离色谱进样， 同时制备 0.08g/L 的低浓度样品用于制备HPLC，以避免进样压力过高。
03.方法
表2 制备液相色谱条件
表3 制备液相色谱条件
将纯化后的产物进一步进行HPLC 分析，在 280nm 下检测香兰素。
结果和讨论
最终得到的制备色谱图如图 5 和图 6 所示。两个色谱图中的蓝色区域代表收集的香兰素馏分。这些馏分进一步使用 HPLC 进行分析，在 280nm 下的检测结果如图 7 和图 8 所示。
图 5 制备色谱在280nm处的紫外色谱图
图 6 VERITY CPC 250 PRO在280nm处UV色谱图
这些馏分进一步使用 HPLC 进行分析，在 280nm 下的检测结果如图 7 和图 8 所示。
图 7 通过制备色谱柱纯化，收集的香兰素馏分合并后，在280nm处HPLC分析图谱
图 8 通过VERITY CPC 250 PRO离心分配色谱柱纯化，收集的香兰素馏分合并后，在280nm处HPLC分析图谱
两种技术都能获得纯度大于 99% 的香兰素（表 4）。此外，使用 CPC 的回收率大于 91.8%（表 4）。这表明 CPC 能够避免由于潜在的不可逆吸附而导致的样品损失。
在制备型 HPLC 中洗脱香兰素需要 500毫升溶剂（图 5），而在 CPC 中洗脱香兰素仅需使用 360 毫升溶剂（表 4）。由此可以得出，每进样 1 g的原料，制备型 HPLC 需要使用 5.3 升的溶剂，而 CPC 只需要使用 0.1 升的溶剂。
本研究中由于制备型 HPLC 的进样量低，无法得到回收的香兰素的质量和产率。
表 4 通过制备色谱法和离心分配色谱法对香兰素进行纯化的结果对比
结论
PLC 2050 能够高效便捷地与 CPC 和 prep HPLC 色谱柱搭配使用，用来进行纯化工作。在本文中， 通过对比 CPC 与 HPLC 制备柱，展现了 CPC 的优势（表 4）。与 prepHPLC 相比， CPC 溶剂消耗量更低且无需固定相（如二氧化硅），进样量更大，而纯化效率近似。这些基于实验室级仪器得到的纯度，产量，产率等数据，可以放大并应用到工业级 CPC （如 Gilson VERITY 工业级 CPC ）解决方案。
参考文献：
1.Vanillin; Walton N.J. and Al; Phytochemistry, 63, (2003), 505-515
2.Zietlow et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22):6271-5
