过氧化物酶活性的测定方法

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化.

一、原理
在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在 470 nm 处有最大吸收,可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性.

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料
马铃薯块茎.

（二）试剂
1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）.
2 ．反应混合液：100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中,加入愈创木酚 28 μl ,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μl ,混合均匀,保存于冰箱中.

（三）仪器设备
分光光度计,研钵,恒温水浴锅,100 mL 容量瓶,吸管,离心机.

三、实验步骤

1 ．称取植物材料 1 g ,剪碎,放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,以 4000 r ／ min 离心 15 min ,上清液转入 100 mL 容量瓶中,残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,贮于低温下备用.
2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ,作为对照,另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之）,立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 读数一次.

四、结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 ΔA 470 /[min ? g （鲜重） ] 表示之.也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示.
过氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化.W ——植物鲜重,g .
V T ——提取酶液总体积,mL .
V s ——测定时取用酶液体积 ,mL .
t ——反应时间,min .