AO/PI双染试剂盒说明书
一、产品简介及特点：
AO/PI双染细胞凋亡检测试剂盒是采用AO/PI探针双染细胞核的方法检测凋亡细胞的状态，是细胞凋亡形态学研究常用的染色方法。
叩啶橙(Acridine Orange，AO）为一种具有细胞膜通透性的荧光染料，该染料能透过活细胞膜，使核DNA和RNA染色。它与细胞中 DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，AO 与dsDNA结合时发出绿色荧光，而与ssDNA和RNA结合时发出红色荧光。当与 DNA结合时，它与荧光素在光谱上非常相似，激发最大值为502nm，发射最大值为525nm(绿色)。当它与RNA结合时，激发最大值移至460nm（(蓝色)，发射最大值移至650nm(红色)。
在荧光显微镜下观察，叶啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。叫啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒;而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
Propidium lodide是一种 DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm,产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。
AO/PI双染试剂盒说明书
二、产品组成：
名称规格 | 50T |
组份A:AO染色液 | 500μl |
组份B:PI染色液 | 1000μl |
组份C:试剂C | 10 ml |
三、自备材料：
1、荧光显微镜、激光共聚焦、流式细胞仪、离心机、移液器、冰箱、冰盒
2、PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）)
3、离心管、吸头、一次性手套
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四、操作步骤(仅供参考)：
染色工作液配制:
1．根据样品数，按下列比例配制染色缓冲液。取100 uL试剂C用900 uL纯水稀释，充分混匀即成染色缓冲液。
2．每500 uL染色缓冲液加入5 uL AO染色液和10 uL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。
【注】:不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。
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悬浮细胞染色
1. 收集样本细胞，细胞数量在10X105个以内。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 用500 uL染色工作液将细胞重悬。
4. 轻轻混匀后4℃避光孵育10-20分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。
贴壁细胞原位染色;
1. 用PBS洗涤细胞2次。
【注】:注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。
2. 细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。
3. 37℃孵育细胞10～30分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
【注】:若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
4. 吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2~3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。
结果分析:
在荧光显微镜下，选用488 nm激发光镜检:
AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。
当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。
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五、注意事项：
1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3、本染色试剂盒可用于细胞、细胞涂片等。以下以悬浮培养细胞的荧光显微镜检测为例，其他方法请参阅相关资料。
4、贴壁细胞可以消化下来染色，也可以直接原位染色。
5、所有细胞都染成了红色和绿色，没法区分活细胞和死细胞?
AO/PI染色是一种凋亡形态学的染色方法,需要染色后结合核酸的形态变化进行分析，不是通过颜色差异进行细胞类型的区分。
AO染色是既有绿色也有红色的，它与细胞中DNA和 RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光。AO 与dsDNA 结合时发出绿色荧光，而与 ssDNA和RNA结合时发出红色荧光。
染色后观察核酸的形态，正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。当细胞凋亡时，核染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。
凋亡细胞出现细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为小片段，形成凋亡小体。
六、有效期：2-8 ℃避光有效期为半年
注：拆封后请尽快使用，有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期。
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