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iPSC单克隆案例分享丨MG基质胶、CEPT提高iPSC单克隆效率

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2023/5/22 14:32:59

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是指通过人工对体细胞进行重编程，逆分化培养出的一类具有类似人胚干细胞特征的多能干细胞。它们具有体外培养无限增殖、自我更新的能力以及巨大的分化潜能，在药物发现、合成生物学和细胞治疗等方面具有巨大的前景。随着iPSC应用的增多，势必有越来越多的需求去建立标准化的单克隆iPSC主细胞库（MCB），用于后续的可持续供应且稳定的生产工艺流程中。



材料与方法

Cytena单细胞打印机通过喷墨式打印技术，温和的将单个细胞自动分离到标准的96或384孔板中，分选过程中，高分辨率的光学系统可根据细胞直径、圆度或荧光强度分选出需要的单细胞，且提供单细胞来源的图像证据，有助于通过监管机构的审核。

为了提高单细胞分选效率，比较不同重悬体系对分选过程的影响；为了提高克隆效率，对不同基质胶对克隆效率的影响进行了比较；比较了用Y-27632或CEPT处理后的克隆效率；通过核型分析，判断CEPT的处理是否会引起遗传异常。

01 CEPT四组分混合物的确定

通过超低细胞密度的高通量筛选确定四因子混合物CEPT：Chroman 1 (ROCK 抑制剂), Emricasan (半胱天冬酶抑制剂)，Polyamines（多胺）和Trans-ISRIB（综合应激反应抑制剂）。其用于改善细胞存活、细胞附着和蛋白质翻译。

02样品准备

iPSC细胞：细胞培养4/5天时，达到60%汇合度，使用TrypLE select消化细胞，使用 20-40 μm 过滤器（清除悬浮液中可能阻碍芯片的团块），最后重悬于HBSS/E8 medium/DMEM/StemFlex+ Rock抑制剂中，浓度为0.5x106  cells/mL。

03单细胞分选

使用Cytena单细胞打印机可直接捕获喷嘴图像作为严格单细胞分选证据。流式分选作为对照组。


04克隆增殖

选择八个利用CEPT产生的克隆并建立克隆细胞系。


05核型分析

四次传代后，对八个选择的克隆细胞系进行核型分析


结果

使用mTeSR/E8 + Rock抑制剂分别对样品进行重悬，浓度为0.5x 106 cells/mL进行上机分选都有不错的表现。在同一iPSC细胞中，对比了LN521和LN521+E-Cad的差异，发现E-cad的存在对单克隆率没有提升效果，单克隆率反而降低。MG基质胶能很显著的提升iPSC细胞单克隆率，在LN521基质胶中，单克隆不到1%，但是MG基质胶中却有38%的单克隆率。在第三个iPSC细胞中，用添加了RevitaCell的mTeSR1重悬细胞，然后分选单细胞在MG基质胶的孔板中，获得了68%的单克隆率。
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图1：使用不同重悬培养基以及不同基质胶处理后的单克隆率表（MG: Matrigel; LN521: Laminin 521; E-Cad: E-Cadherin）

Cytena 单细胞打印机分选过程中能留下多张喷嘴图片，在喷嘴的ROI检测识别区域，软件能识别细胞的直径、圆度等参数，确认细胞的“良好状态”，符合要求的“强壮的”单细胞到孔板里，不符合要求的细胞则被真空吸走。喷嘴图片证实单细胞来源，单细胞铺板效率＞95%。

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图2：单细胞率[1]


Yu Chen[2]等发现，相比于Y-2762,CEPT能显著提升iPSC的单细胞过程中的存活率，相同小分子处理下，用Cytena单细胞打印机分选iPSC细胞，一块96孔板获得68个iPSC单克隆孔，比流式细胞仪分选高出~20%。
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图3：克隆恢复率 图4：CEPT可提高单克隆率


随机选择八个利用CEPT产生的克隆建立克隆细胞系，四次传代后，所有克隆细胞系（8/8）均为核型正常，表明CEPT不会引起遗传异常。

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图5：CEPT未引起遗传异常


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图6：Cytena 单细胞打印机用于iPSC基因修饰后的CLD


讨论

iPSC对培养环境的变化十分敏感，如pH值、渗透压、营养供应、机械应力/剪切力等。在传统的培养条件下，iPSC通常在涂有各种细胞外基质表面上密集生长。在对iPSC基因组编辑过程中，最大的挑战之一是获得阳性单克隆细胞。单个iPSC的生长过程中，减少了细胞和细胞之间、细胞与细胞外基质的接触，容易诱发细胞失巢凋亡，导致单细胞存活率显著下降。一方面，抑制细胞失巢凋亡的产生，会改善单细胞存活率；另一方面，温和的自动化分选系统可以进一步优化阳性单克隆细胞的筛选平台。

在此研究中，使用Cytena 单细胞打印机展示了一个具有代表性的高效分选iPSC的工作流程。分选过程中通过捕捉喷嘴图片证实单细胞来源，单细胞铺板效率＞95%（图2）；一块96孔板获得68个单克隆孔（图3）；使用mTeSR/E8进行重悬，在基质胶的选择中，使用MG可以显著提高iPSC单细胞恢复率；四组分CEPT处理后的iPSC克隆有效率更高（图4），且不会引起遗传异常。

Cytena单细胞打印机的高效的微流控细胞分选，搭配小分子混合物CEPT的工作流程，一方面提升了iPSC的单克隆效率，同时单克隆又保持了原有的形态学特点，这一工作流程将突破现有的技术瓶颈成为新的标准流程，能满足后续的单克隆iPSC主细胞库（MCB）的建立需求，用于日后的可持续供应和稳定的生产流程。

参考文献:
1.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020).
2.Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021).

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