线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)的应用及使用方法！

       线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)的应用及使用方法！

一、背景

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用JC-1探针检测线粒体膜电位变化的试剂盒，可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。

本试剂盒染料JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想荧光探针。与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别。

JC-1有单体和聚合体两种形式，两者的发射光谱不同。JC-1单体(J-monomer)的激发波长为514nm，发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的激发波长为585nm，发射波长为590nm。

JC-1可以透过细胞质膜进入细胞，以单体状态游离于胞质内，正常健康细胞的线粒体的膜电位较高，具有极性，JC-1依赖于膜电位的极性被迅速摄入线粒体的基质内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体488nm激发时的发射波长为590nm，发射光为橙红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；当细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，线粒体膜电位较低，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，从线粒体内释放到细胞质，此时JC-1为单体，488nm激发时发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

二、使用方法

1、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5X105个。

2、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

3、用500ul JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15-30分钟。

4、在4°C，300-500×g力离心间5分钟，弃培养基，收集细胞。

5、用冷PBS洗涤细胞两次。

6、用500ul PBS将细胞重悬。

7、用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

三、应用

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)可以用于精子线粒体膜电位检测在评估男性生育力中的作用研究：

探索育龄男性精子线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)与精液质量、血清性激素、促性腺激素的关系及其在评估男性生育力中的作用。

方法：募集2017年6月-2020年11月至就诊的男性志愿者及其配偶共90例,收集基本资料,进行精液常规分析,检测精子MMP、精子顶体反应率(acrosomal reaction,AR)、血清性激素(T、E2)、促性腺激素(LH、FSH、PRL)、生育力指数(fertility index,FI)。分析募集者精子MMP与上述其他各指标之间的关系;计算本组募集者精子MMP截断值并根据截断值分为高精子MMP组和低精子MMP组,同时分析比较两组在本研究观察期内募集者配偶的怀孕率;根据精子浓度、精子前向运动率(progressive motility,PR)及正常形态率是否低于参考下限值,将男性志愿者分为正常组和异常组,分析上述各指标的组间差异。

结果：(1)异常组与正常组一般特征及精液参数对比:一般特征具有可比性,两组男性志愿者配偶随访期内怀孕人数和两组既往配偶有生育史人数无显著性差异(p>0.05);精液量、p H、畸形精子指数(the teratozoospermia index,TZI)、精子尾部缺陷率、血清性激素及促性腺激素、精子AR无显著性差异(p>0.05)。异常组精子畸形指数(the sperm deformity index,SDI)、精子头部及颈部缺陷率较正常组高(p<0.05),精子MMP和FI较正常组明显降低(p<0.05)。

(2)精子MMP与各指标相关分析:精子MMP与FSH(r=-0.258,p<0.05)及精子头部畸形率(r=-0.254,p<0.05)呈负相关,与精子浓度(r=0.285,p<0.05)、精子正常形态率(r=0.319,p<0.05)、精子PR(r=0.504,p<0.05)、精子总活力(PR+NP(non-progressivity motility,NP))(r=0.463,p<0.05)、FI(r=0.443,p<0.05)呈正相关。与年龄、血清激素、LH、PRL、SDI、TZI及精子AR无统计学相关性(p>0.05)。

(3)精子MMP对精子质量正常与否的ROC曲线分析:精子MMP曲线下面积(AUC)为0.814(p<0.05,95%CI:0.725-0.903),Cut-off值为0.507,敏感性0.73,特异性0.87。

(4)高精子MMP组和低精子MMP组募集者配偶怀孕率的对比:精子MMP>50.7%组男性志愿者配偶随访期内怀孕人数明显高于精子MMP≤50.7%组(χ2=5.035,p=0.025),两组既往配偶有生育史人数无显著性差异(p>0.05)。

结论：精子MMP是反应精子功能、精确评价精子质量及男性生育力的潜在指标,提示临床中在精子常规参数的基础上结合精子MMP能更精确全面地评价育龄男性的生育力。

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