技术文章

6月15日，比尔∙盖茨在京访问 GHDDI，并发表题为“以创新之力，应对全球挑战”的主旨演讲，并表示：“mRNA 疫苗技术使预防结核病和疟疾等疾病的疫苗成为可能。”mRNA疫苗的发展也得益于冻干技术这一领域的突破性应用。
疫苗可以说仍是mRNA赛道上目前最主要的一大研发方向，而在此之外，逐渐成熟的mRNA技术也被应用于其他药物领域，包括细胞与基因治疗、抗体药物、蛋白替代疗法等，

具体如下：

mRNA技术核心离不开纳米颗粒
预防传染性疾病绝不是mRNA的全部使命，用mRNA技术攻克肿瘤才是接下来的主战场。mRNA技术正在向各个领域渗透，带来新的变革。作为mRNA技术核心的药物递送系统绕不开纳米颗粒。
美国国家科学技术委员会(NSTC)早在2000年启动了国家纳米技术计划(NNI)，并为该领域提出了明确的计划和重大挑战，纳米颗粒(nanoparticles)占据了该计划的很大一部分。纳米颗粒可以提高被封装货物的稳定性和溶解度，促进跨膜运输，延长循环时间，从而提高安全性和有效性。由于这些原因，纳米颗粒的研究已经被广泛应用在癌症医学、免疫治疗和体内基因编辑中。

纳米颗粒递送mRNA用于蛋白质替代疗法、基因组编辑和mRNA疫苗（参考资料1）[1]

纳米颗粒极其多样化，从固体脂质结构到脂质体，甚至是包含金/二氧化硅颗粒的设计。纳米颗粒最近的作用之一是提供癌症治疗的药物。它们的复杂的结构通常是基于核壳的，药物被纳米颗粒包裹并运输到全身。这些药物可以直接指向身体的特定区域，降低毒性，提高药物的有效性。使用脂质纳米颗粒 (LNPs) 包裹SARS- CoV-2 mRNA，作为最近开发的几种COVID疫苗的基础。
大多数纳米颗粒配方都是在溶液中，尺寸分布不均。这些纳米悬浮液可能是不稳定的，并受到沉降、团聚、晶体生长或化学反应等问题的影响。冻干可以增加这些颗粒的稳定性，这也有利于在其中加入的药品的稳定性。
美国康涅狄格大学Xiuling Lu博士对此曾进行了一场网络研讨会专题演讲并描述了冷冻干燥纳米颗粒的挑战以及如何与Robin Bogner博士合作，她的团队设计并评估了冻干LNPs的解决方案。这份冻干技术报告总结了网络研讨会。
我们还在下文为大家推荐了几款国际大厂都在采用的进口冻干机设备，以供参考。

冻干的挑战
冷冻干燥过程中存在许多挑战，其中一些是由于冷冻过程中冰的形成，会导致颗粒聚集或纳米颗粒的结构损伤。所得到的饼形态在循环开发过程中对特定的玻璃化转变和塌陷温度(分别为Tg’和Tc)也很敏感。即使在冻干燥工艺优化后，也需要考虑重构时间，方便最终用户给药。
通过评估和优化这些参数以及使用冻干保护剂，可以改善每种纳米颗粒和药物的冻干条件。理想情况下，最佳的冻干产品将表现出优雅的饼状形态，不会坍塌，保持纳米颗粒的结构和药物包封，含有低水分 (<2%) 可以长期稳定，并在短时间内重构。
Lu博士研究了三种不同纳米颗粒的冷冻干燥条件：
· 固体脂质纳米颗粒(SLNs)
· 聚合物纳米颗粒(PNs)
· 脂质体(Lipos)
在研究配方和冷冻条件对纳米颗粒质量的影响以及最终产品的长期稳定性之前，用一系列冻干保护剂测定了三种纳米颗粒的Tg’和Tc。

这些实验采用带ControLyo® 技术的SP LyoStar3冷冻干燥机，使冰成核得到控制，所有小瓶同时冻冷成核。

配方的影响
比较了三种冻干保护剂对冻干纳米颗粒 (SLNs、PNs和Lipos) 的保存效果：
1. 蔗糖 (1：5和1：10)
2. 海藻糖 (1：5和1：10)
3. 甘露醇 (1：5和1：10)
添加任何一种保护剂都没有导致蛋糕形态的显著变化， 在任何小瓶中都没有产生合理的蛋糕。然而，有证据表明在一些小瓶中会收缩，特别是没有冻干保护剂的脂质体。
虽然冻干蛋糕的优雅性相似，但通过添加冻干保护剂，大大减少了重构时间。在PNs中，甘露醇 (1：5和1：10) 将这次时间从35分钟减少到5 min以下 (图1)


图1：添加冻干保护剂对重构时间的影响

我们还通过测量冷冻干燥前后的颗粒大小和均匀性 (多分散性指数，PDI) 来评估纳米颗粒的成功冻干。冻干保护剂能保持SLNs和Lipos的颗粒大小，其中蔗糖和海藻糖比甘露醇更有效。在PNs中，添加或不添加冻干保护剂对颗粒大小影响不大。PNs配方中存在的PVA可能提供一定的聚集保护。蔗糖和海藻糖是保持颗粒大小和改善粒径分布强有效的冻干保护剂。SLNs和Lipos需要冻干保护剂来维持尺寸分布，而PNs需要冻干保护剂来缩短重构时间。

冻结条件的影响
冷冻是冻干过程中的一个关键步骤。由于不受控制的冻结 ，可能会出现许多问题，如批次内冰晶大小的不均匀性， 以及由微小冰晶造成的更高的塌陷风险。
ControLyo® 是一种控制成核的技术，实现更高的成核温度，产生更大的晶体，从而加快初级干燥时间。
在本研究中，我们比较了不同冷冻条件对每种纳米颗粒的影响。
1. 无控制的冰成核：冷却速率为1℃/min至-40℃；
2. 快速冻结：将颗粒浸入液氮中，然后放入冷冻干燥机进行干燥；
3. 慢速冻结：使用ControLyo®在-4℃，冷却速度0.2℃/ min至-40℃；
4. 控制成核：使用ControLyo®在-4℃和-8℃控制冰成核，冷却速率为1℃/min至-40℃。
在快速冻结条件下，所有产品均出现极严重的裂纹，不含冻干保护剂的 Lipos均发生塌陷。不受控制的冰成核也产生了显著的蛋糕收缩。慢速冷冻是一种能同时增加含冻干保护剂的SLNs 和 Lipos 的粒径和均匀性(PDI)的冷冻条件(图2)。然而，慢速冷冻并不会影响PNs的粒径或粒径分布，可能是由于PVA的存在，如前所述。


图2：冷冻条件的影响：结果—固体脂质纳米颗粒

冷冻条件也不影响所有纳米颗粒的重构时间和剩余水分含量，尽管添加有效的冷冻保护剂降低了所有纳米颗粒的这两个参数。
无菌洁净室的冰成核温度一般较低，因为控制的环境符合ISO 5或A分类。

长期稳定性
比较了不同的储存条件，以确定纳米颗粒的长期稳定性。
1．液体配方在室温 (RT)
2．液体配方在4℃
3．未控制冰成核的冻干产品在室温(RT)
4．控制冰成核的冻干产品在室温(RT)
在室温（RT）下以液体形式储存SLNs，在10天内显著增大了100%的粒径(图3)，并迅速提高了PDI。在4℃的冰箱中储存SLNs稍微好一些，三个月时观察到颗粒大小增加了100%。通过冷冻干燥，该纳米颗粒的储存得到了显著改善。而当使用Controlyo控制成核方法时，3个月后颗粒尺寸没有变化。目前还没有Lipos的数据。


图3：不同冷冻干燥和储存条件下SLNs的平均粒径变化

相比之下，PNs的大小和均匀性不受任何存储条件的显著影响，因为它们在所有条件下都相对稳定。

总结
在-4℃或-8℃下控制冰成核的冷冻干燥纳米颗粒可以提供更好的饼形态而不塌陷，冻干保护剂能够保存颗粒大小，改善颗粒均匀性，并缩短重建时间。然而，这些条件在不同的纳米颗粒之间是不同的，所以单独优化每个产品是很重要的，而不是假设条件是可互换的。
由于冷冻干燥产品的主要原因是增加长期稳定性和解决冷链运输的难题，因此仔细评估每个纳米颗粒的冻干条件最终将有利于许多药物和疫苗产品的生产和储存能力。

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