在一次性生产解决方案初次发布后不久，一次性技术 （SUT）就被行业接受。从市场的角度来看，单克隆抗体(mAb)代表了一个重要的产品类别，该等实体的生产平台具有高度一致性的特点。因此，设备供应商最初专注于开发用于制造该产品组的设备和相关一次性组件。因此，设备供应商最初专注于用于生产该产品组的设备和相关一次性组的开发。
在过去十年中，抗体偶联物药物（ADC），在广义上也称为生物偶联物，采用了一次性制造技术。这一趋势是由产品安全考虑(避免交叉污染)和职业暴露限制(OEL)要求驱动的。尽管最初在临床上遇到了挫折，但ADC代表了一个不断增长的细分市场，有70多种产品处于临床开发阶段，并推出了4种产品，即Kadcyla™（罗氏基因泰克），Adcetris™（西雅图遗传学），Mylotarg™和Besponsa™（辉瑞）。
从作用方式的角度来看，ADC被认为是化疗药物，因为它们结合了小分子的细胞毒性或细胞抑制活性与mAb的选择性。抗体单元特异性地识别肿瘤抗原，因此，有效载荷可以传递到所需的靶标。这些有效载荷的全身毒性太高，无法在没有靶向功能的情况下使用。一个关键的生产步骤是在mAb和高效有效载荷（即活性药物成分（HPAPI））之间形成共价化学键，也称为“弹头”或“毒素”。常见的有效载荷是美登素类化合物（DM1和DM4），奥利他汀（MMAE和MMAF）和吡咯苯二氮卓类（PBD）衍生物，后者显示出最高的效力。有效载荷通过不同复杂性的连接子与mAb偶联。在大多数情况下，这些连接子与mAb恒定结构域中的半胱氨酸或赖氨酸残基结合。半胱氨酸基和赖氨酸基偶联示意性地显示在图1中。有关ADC结构和功能方面的更多详细信息，我们向感兴趣的读者推荐Hoffmann等人的评论论文。
除上述ADC外，术语生物偶联物还包括其他化学修饰的蛋白质，这些蛋白质通常不被归类为HPAPI，例如：
● 聚合物（例如聚乙二醇、淀粉和聚唾液酸）偶联mAb，其中聚合物单元的功能是改变mAb的药代动力学
● mAb与抗生素偶联，可有效靶向治疗细菌感染
● mAb与结合放射性核素的螯合剂偶联，用于向靶向癌细胞递送细胞毒性辐射（放射免疫疗法）
● 弱抗原（例如细菌多糖）与蛋白质性质的强抗原的结合疫苗，可引发针对弱抗原的更强免疫应答
虽然选择性通常通过使用完整的单抗来保证，但该功能可以由工程抗体(如片段抗原结合(Fab)、单链可变片段(scFv)、单域抗体(sdAb)或另一种抗体模拟支架(affbody、DARPin、anticalin、alphabody等)来替代。 生物偶联物的结构复杂性，加上ADC的高效能，使得这些产品的生产成为一项具有挑战性的任务。
2007 年，龙沙是投资专用生物偶联设施的合同制造组织之一，当时的重点是 ADC。在调试后的 10 年中，该设施发布了来自 30 多种不同产品的 500 多个临床和商业批次。玻璃和不锈钢多用途设备用于初始生产，一次性技术的采用仅限于无菌过滤器、转移管、取样装置和储物袋。2014年，推出了一个一次性的生产平台，该平台包括 50-200L一次性混合袋技术和切向流过滤 （TFF） 撬块，适用于高达3 m2 的膜面积。从那时起，大多数临床项目都是在更大规模的端到端SUT生产设置中执行的。这一发展是由以下好处推动的：
● 降低操作人员接触有毒化合物的风险
● 避免了每个HPAPI的生产都需要专用设备，这在项目周转率高的情况下是一个重大缺陷
● 由于消除了交叉污染问题，缩短了生产中的实施时间;从清洁风险评估开始，扩展到执行试样研究、开发特定产品的清洁程序和清洁验证的清洁计划已经过时
● 考虑到ADC的稳定增长正在挑战现有分析方法的检测和量化极限，减少清洁监测的分析工作
● 减少清洁过程中有毒废物流的数量。
本章下一节将讨论使用基于聚合物的生产设备的缺点，描述ADC制造中一次性解决方案的开发进展。
在ADC工艺中使用一次性产品挑战
有机溶剂的使用
一个挑战是产品接触表面暴露于有机溶剂中，这可能会对物理稳定性产生负面影响，并可能导致可浸出物水平升高。美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局的法规明确规定，包括一次性使用系统在内的加工设备不应对产品安全和质量造成任何危害。典型的亲脂性负载通常溶解在有机溶剂中，极性非质子溶剂如二甲亚砜，二甲基甲酰胺，或二甲基乙酰胺是常用的。另外化学反应通常在含有10-25%有机溶剂的缓冲水溶液中进行，以便在偶联步骤中保持小分子的溶解度。随后的纯化步骤应设计为清洗溶剂、可浸出物、偶联试剂（即活化剂）、非偶联有效载荷和淬灭剂。与工艺溶液接触的一次性材料应仔细评估在所选溶剂浓度和工艺条件下的相容性。Weibing Ding[8]指出了在基于科学的风险评估中需要考虑的以下方面：（i）工艺流体和一次性系统之间的化学相容性，（ii）产品成分，（iii）材料接触面积，（iv）接触时间，（v）工艺温度，（vi）预灭菌方法，以及（vii）与最终容器封闭系统的距离。
幸运的是，大多数生物工艺容器和一次性混合袋的产品接触层由聚乙烯组成，聚乙烯与溶剂含量低于25%的水溶液相容。然而，一次性组件，如由聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯或聚偏二氟乙烯制成的连接器可能对类似的水溶剂混合物的抵抗力较低，这可能导致化学品浸出增加，从而影响产品质量。此外，与25-100%的溶胶排放含量相关的问题也带来了挑战，这可以通过在一次性使用模式下使用玻璃瓶和不锈钢连接器来解决。
总之，全面的可浸出物风险评估和仔细选择一次性使用的设备组件相结合，可以将最终产品中的可浸出物浓度降低到可接受的水平。
HPAPI的安全性和处理
ADC生产需要处理具有细胞抑制或细胞毒性特征的高效成分。因此，需要特别注意职业安全和健康以及避免交叉污染。因此，保护雇员或合同工人不因接触在制造过程中处理的化学品而对健康产生任何负面影响是至关重要的。化工行业已经为化合物（包括药物中间体和药物）制定了分类系统，该系统基于定义OELs，即工作区域空气中定义的化学品的最大可接受浓度。随着时间的推移，建议的分类系统已经演变成SafeBridge标准，该标准有四个类别。用于ADC生产的化学品的典型OELs范围在100到1ng/m3之间。
在工人保护和职业健康方面的圣杯是“封闭式制造”，与固定不锈钢管道互连的不锈钢设备是封闭式生产的经典解决方案。然而，近年来，我们已经能够证明，从职业安全和交叉污染控制的角度来看，商用一次性设备是一个不错的选择，并且可以得出结论，一次性工艺解决方案非常适合封闭、无菌的处理。所选溶液工作可靠，能够承受偶联过程所需的相当温和的反应条件（温度、压力和溶剂浓度），因为更具腐蚀性的工艺条件也对mAb有害。
许多公司细分为六个产品类别（安全桥1和2为三个类别，安全桥3和4为3类）。这允许工作标准定义具有更高的粒度。下表总结了中概述的信息。
用萘普生模拟典型接合过程的替代研究经常进行，以验证遏制。生产区域的表面拭子和空气中颗粒的监测为生产设备和设施的适用性提供了证据。
关键单元操作
1 搅拌罐中的反应
除了转移，在生产生物偶联物时需要考虑的关键单元操作是搅拌槽、TFF、柱层析、在线过滤和冻融循环中的反应。
传统的生物制药生产主要使用一次性的搅拌槽来保持中间产品溶液的均匀性，而生物偶联物的生产涉及在一次性搅拌槽中进行化学反应。这些例子包括（i）mAb的还原（半胱氨酸偶联），（ii）选择性再氧化，以及（iii）连接子有效载荷与mAb的偶联。对于某些试剂添加步骤，所得反应溶液的快速均质化对于获得所需的产品关键质量属性以及获得多个批次的可重现产品曲线至关重要。由于试剂可充注于有机溶剂中，因此一次性设备应保证在适当短的时间范围内将水相和有机相混合到均匀的溶液中。
2 切向流过滤
在ADC生产中，TFF用于（i）清除溶剂，（ii）去除小分子反应物，如氧化剂和还原剂或过量的连接子有效载荷，（iii）缓冲液的交换，（iv）（中间）产物的浓度。根据药物特性和目标药物浓度，产品溶液可能变得非常粘稠。在我们的设施中引入端到端一次性生产ADC时，市售TFF设备和相关流量组的设计只能承受2.5 bar（g）的压力。因此，龙沙团队不得不重新设计和调整流量组，以抵抗更高的压力。重新设计的一次性 TFF 歧管可在高达 4 bar（g） 的进料压力下运行。最初可用的 1/2“ TFF 撬块仅限于 3 m2 膜面积，这将批量大小限制为 100-200 g 蛋白质。最近推出的 1“ 一次性 TFF 撬块可容纳高达 10 m2 的膜面积，典型批量大小可达 1 kg，从而扩大了 SUT 在 ADC 制造中的应用范围。使用后处理与产品接触的材料（包括膜和歧管）大大减少了处理受污染设备所需的时间，并将清洁过程中产生的有毒废物和需要特定处理的废物的数量降低。
3 色谱法
虽然早期的ADC产品避免了色谱步骤，但临床开发中许多产品的过程包括精纯步骤，通常用于去除大分子产品相关杂质。从操作的角度来看，最好使用预填充柱，因为这些可以在不打开的情况下处理，从而避免操作员接触高效化合物，这种风险在多用途色谱柱的拆包过程中特别高。
4 过滤和转移
在生物制药生产的情况下，0.2毫米过滤操作基本上服务于生物负荷控制的目的。深度过滤偶尔用于去除加工过程中形成的骨料。蠕动泵与生物丁橡胶管相结合，适用于标准输送和过滤步骤。由于其接触面积大，工艺过滤器在可提取物和可浸出物风险评估中需要高度关注。
5 原液冻融
根据药品生产场所的工艺量和能力，生物偶联原料药(BDS)在-20℃或-65℃以下冷冻和储存之前被释放到冷冻容器、二维 (2D) 袋、大瓶或瓶子中。从操作角度来看，冷冻容器和袋子比瓶装解决方案更受青睐，因为它们可以进行密闭分装，而无需“A 级”洁净室环境。
使用2D袋作为5-20升体积的冷冻容器已经变得非常流行。其原因是（i）溶液的一次性使用性质，（ii）使用配备无菌连接器和断开器的歧管的封闭分装能力，（iii）提高可扩展性，（iv）开发用于安全运输的保护壳，（v）对低温浓缩效应和袋子储存的良好控制，以及（vi）更高的冷藏室储存密度。上述保护壳的开发有助于克服诸如在低于-65°C的温度下袋脆性增加等弱点。需要考虑聚合物的玻璃化转变温度以及端口和管道在运输过程中承受机械应力的情况。另一个可取的特点是与冻融设备解决方案的连接性和灵活性，例如板式冻融装置和静态或具有主动空气再循环的鼓风冷冻机，以避免投资购买额外的设备。由于冻融速度会影响产品质量，因此控制冻融的趋势也很明显。
半胱氨酸偶联过程–ADC生产工艺案例研究
半胱氨酸偶联过程在龙沙ADC设施中的一次性设备中端到端运行，每批提供数百克ADC。这种一次性的生产设置使内毒素控制到某些治疗适应症所需的非常低的浓度。偶联和渗滤步骤在一次性混合袋中进行，混合袋的处理体积在 10 至 200 L之间，含有 200g API。
该过程从使用还原剂解冻和还原mAb开始；常用的还原剂是三（2-羧乙基）膦（TCEP）的水溶液，可将mAb的分子间二硫键还原为两个硫醇基团。标准的一次性混合袋非常适合此操作。第一代半胱氨酸偶联过程直接进入偶联步骤，这通常导致统计学分布的药物抗体比（DAR）为0-8。ADC药物具有特定的平均DAR，通常在2-4范围内.如表4.所示，第二代半胱氨酸与工程抗体的偶联过程引入了选择性再氧化步骤（通常使用脱羟基抗坏血酸），该步骤只保留选定的硫醇功能，并恢复mAb中确定位置的二硫键。这种还原后选择性再氧化的过程是位点选择性结合的先决条件。在偶联步骤之后，这导致具有相同两个硫醇偶联且DAR为2的单产物物种。 在选择性再氧化之前，过量的还原剂通过在单次使用的TFF设备中进行透析过滤来去除。然后对还原的mAb进行选择性再氧化。
在下一步中，mAb中剩余的硫醇功能与一定量的连接子有效载荷分子偶联，并在反应完成后淬灭过量的药物连接子（N-乙酰半胱氨酸已被确定为合适的淬灭试剂）。然后在TFF操作或随后的精纯色谱步骤中清除工艺杂质。后者使用预填充柱在一次性色谱撬块上运行，以提供数百升规模的高纯度产品。在ADC生产中使用预填充柱与一次性设备结合使用被证明特别有益，因为：
● 对色谱柱填料和拆包设备没有要求
● 节省了包装和拆包色谱柱的时间;色谱柱还可以在一次性模式下灵活使用，也可以清洁和储存以进行多次使用和
● 职业暴露风险降低；HAPI污染树脂的开放式处理需要采取重大的密闭措施，以确保操作人员的安全并控制交叉污染风险。
然后，精纯步骤的产品池通常以10-20倍的倍数浓缩至通常超过10克/升的目标浓度。考虑到高浓度因素，还应将设备滞留因素考虑在内。此外，小分子偶联伴侣的高浓度和特性会影响粘度。
浓缩产品最终配制成BDS，过滤并填充到PETG瓶或2-D袋中，冷冻至-20°C以下或-65°C以下。 必须注意避免低温浓缩效应，这可能会对产品质量产生负面影响。
总结和结论
ADC和其他生物偶联物的生产要求严格，以确保产品质量和安全的工作条件。此外，有机合成与生物加工中更常用的技术相结合是相当不寻常的。然而，正是与生物工艺的接近鼓励了利用SUT制造ADC。许多优点包括改善职业暴露风险状况，降低投资成本，特别是临床生产方面，显着降低交叉污染问题，以及大大减少清洁过程中的有毒废物流。与不锈钢设备生产相比，使用聚合物基接触材料的一个缺点是可浸出物风险增加。然而，正如许多活动所证明的那样，这种风险可以通过可浸出物风险评估和细致地选择一次性生产解决方案来管理。根据我们的经验，SUT在ADC生产中的利用率在安全性、设备功能和总体项目成本方面是相当或更优。 如本文所示，如今可以使用一次性设备成功生产ADC。现有的规模限制将逐步克服，结合一次性设备方面的进展，将确认SUT进一步应用的趋势。此外，目前用于ADC生产的技术解决方案可能为在化学制造的其他领域实施一次性设备铺平道路。
