活体显微镜(IVM)和光学相干断层扫描(OCT)是两种功能强大的光学成像工具，可以以亚细胞分辨率可视化活体动态生物活动。标记和无标记技术的最新进展使IVM和OCT能够用于广泛的临床前和临床癌症成像，为肿瘤复杂的生理、细胞和分子行为提供深刻的见解。临床前IVM和OCT已经阐明了癌症生物学的许多其他难以理解的方面，而IVM和OCT的临床应用正在改变癌症的诊断和治疗。作者回顾了活体肿瘤成像的IVM和OCT领域的重要进展，重点介绍了关键技术的发展及其在基础癌症生物学研究和临床肿瘤学研究中的新兴应用。
关键词：活体成像,肿瘤,OCT,IVM
高分辨率体内肿瘤成像技术
影像是临床前研究肿瘤临床处理工具。临床成像技术，如磁共振成像和超声，可以对癌症的位置和解剖结构及其随时间的变化进行宏观测量，但缺乏细胞和分子尺度的病变细节。相比之下，活体显微镜(IVM)和光学相干断层扫描(OCT)采用不同的成像机制，提供亚细胞尺度的分辨率，使广泛的临床前和临床癌症调查成为可能(图1)。IVM依赖于用单光子或多光子荧光显微镜(MPM)扫描活体组织，可以在单个时间点进行急性扫描，也可以在几天到几个月的时间内对组织部位进行慢性纵向观察。OCT采用双光束干涉测量法来捕捉光通过组织散射的模式。利用先进的荧光标记技术，IVM是临床前肿瘤生物学研究中表征复杂肿瘤微环境(TME)的有力工具，包括肿瘤进展、肿瘤血管生长与消退、癌细胞转移、肿瘤干细胞增殖、肿瘤相关免疫细胞迁移、肿瘤治疗剂与肿瘤和免疫细胞相互作用等。非线性光学显微镜的最新进展使IVM能够在没有任何荧光标记的情况下可视化主要和转移性肿瘤的细胞外基质。与临床前肿瘤研究相比，IVM的临床应用较少，主要集中在胃肠道肿瘤的内镜评估和膀胱肿瘤的膀胱镜评估。OCT通常作为一种无标记技术用于无创表征浅表皮肤癌和腔内肿瘤的解剖结构。与IVM相比，OCT具有更大的组织穿透性、更宽的视野和更高的成像速度，这使其成为临床肿瘤学研究的一个很有前景的工具，例如检测肿瘤边缘以进行术中手术指导。最近出现的OCT造影剂扩展了OCT在癌症细胞和分子成像方面的能力，例如在临床前动物模型中对肿瘤相关白细胞的近实时跟踪和对过表达的癌症生物标志物的成像。
小鼠MCaIV肿瘤模型的OCT和IVM
最近的一项术中IVM研究显示，在黑色素瘤患者中静脉注射荧光染料，约50%的肿瘤血管不支持血液流动，人类肿瘤的血管直径比免疫组织化学预测的要大。使用OCT，可以使用无标记方法对肿瘤血管进行成像，如斑点强度方差、相位方差和复杂信号方差。这些方法都是基于检测血管中红细胞的动态散射。Bouma等人使用OCT和IVM对植入临床前小鼠模型的MCaIV肿瘤的血管系统进行了成像，发现MPM擅长于显示最小的浅表毛细血管，但OCT在识别肿瘤中心区域更深的血管和荧光示踪剂泄漏的区域(图2)。深度超过1mm的血管可以通过OCT常规观察。而MPM只能对~600 μ m的肿瘤血管进行成像，OCT的时间分辨率比IVM高10倍。OCT可以快速显示肿瘤血管，包括其与宿主血管的连通性，这是对IVM提供的更高分辨率但相对肤浅的血管造影的补充。
光学相干断层扫描(OCT)造影剂用于增强OCT肿瘤血管造影和多重淋巴管造影
无标记OCT能够通过检测具有血管形状和低OCT信号的组织结构来成像淋巴管，因为淋巴液是光学透明的，与周围组织相比反射的光很少。利用这种光学特性，开发了许多无标记OCT淋巴管造影技术。尽管无标签OCT适用于肿瘤血管成像，但它可能忽略了光线明显减弱的深部肿瘤血管和红细胞压积低的精细肿瘤血管结构。Vakoc等人的研究表明，肿瘤周围淋巴网络可以使用这种方法进行分割。通过皮下注射OCT造影剂，可以增强淋巴结构的成像。SoRelle等人报道，通过静脉注射LGNRs作为外源性造影剂，OCT显示了常规OCT方法无法检测到的更深的肿瘤微血管(图3A D)。Si等人最近报道，与无标记OCT方法相比，使用金纳米片(gnpr)作为血管内造影剂，OCT在黑色素瘤肿瘤中检测到的血管多60%，在瘤周组织中检测到的毛细血管多40%(图3E H)。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和单核细胞迁移跟踪使用光学相干断层扫描（OCT）
OCT作为一种新兴的技术被用于研究免疫细胞在TME中的迁移。与IVM相比，OCT具有更大的成像视野和更高的时间分辨率(即IVM扫描300 ~ 20 ~ 200 μ m的组织体积通常需要~1 s，而OCT扫描0.02 s)，但空间分辨率有所降低(表1)。最近，de la Zerda等人报道了基于对比度增强的SM-OCT[15]的白细胞纵向成像。在本研究中，在原位小鼠胶质母细胞瘤模型中，用LGNR造影剂在体内标记tam和活化的小胶质细胞。他们展示了TAM在肿瘤内迁移和分布的近实时跟踪(图4B)。该方法固有的分辨率、成像深度和灵敏度可能有助于详细研究tam在体内的基本行为，包括它们在肿瘤内的分布异质性和它们在调节癌症增殖中的作用。除了白细胞跟踪外，他们还展示了使用对比增强OCT技术[41]在体内跟踪循环肿瘤细胞。本研究使用OCT造影剂LGNRs对骨髓瘤细胞进行标记，标记后的骨髓瘤细胞可通过SM-OCT成像。这项研究标志着OCT被用于检测体内血液中的单个细胞。这种技术能力为活体体内循环的肿瘤细胞的动态检测和定量提供了令人兴奋的机会。对比增强OCT技术的最新进展使OCT能够用于体内细胞生物标志物的分子成像。Boppart等研究小组在乳腺癌大鼠模型中使用磁成像oct进行HER2靶向分子成像，其中抗体结合的铁磁性氧化铁纳米颗粒被用作分子造影剂。在外加变化磁场的作用下，分子靶向纳米颗粒旋转并搅动周围的细胞，导致局部光学散射特性的变化，这可以通过OCT检测到。
未来IVM和OCT在光学设计、算法开发和造影剂方面的创新将进一步增强临床前和临床癌症成像的能力，揭示对癌症生物学更深刻的见解，并实现令人兴奋的临床肿瘤学应用(见未解决的问题)。随着新的造影剂、标记技术和算法的进步，扩展多路性可能是未来IVM和OCT的主要技术进步。例如，更好的光谱分解技术的发展允许使用MPM同时激发和检测在不同细胞和组织区室中表达的七种荧光团。这样的成像可以分辨出更多的标签，并捕获更多的关于癌细胞类型、细胞状态和活体组织结构的信息。体内超分辨率显微镜的创新，依赖于结构照明、随机技术和自适应光学的进步，将开辟全新的研究途径，显著推进我们对癌症生物学分子尺度动力学的理解。这种成像技术最近已被证明用于对斑马鱼和小鼠的活体大脑进行成像。体内光学成像与相关电子显微镜成像、流式细胞术下游分子谱分析、RNA测序和蛋白质组学相结合，可以进一步扩展光学显微镜和相干断层扫描在分子癌症研究中的能力。超高速IVM和OCT的扫描速度比目前的扫描速度快10 100倍以上，可以在大范围内实时跟踪细胞和分子活动。例如，扫描源OCT技术的发展使OCT扫描速率提高了50倍，并将在未来继续提高OCT的速度。除了硬件的改进，先进的计算机算法、云计算和人工智能的发展将极大地促进未来大型IVM和OCT数据集的分析。这些分析在提高早期癌症检测的准确性和效率、癌症类型分类、肿瘤内异质性定位、治疗反应监测以及成像结果与下游分子分析的一致性方面具有很大的前景。
