肝脏是人体最大的消化腺，负责合成、代谢、分解、解毒等500多种功能。它主要由肝细胞和非实质细胞组成，如肝窦内皮细胞（LSECs）、肝星状细胞（HSCs）和Kupffer细胞（KCs），它们通过直接或间接的细胞串扰事件共同调节肝功能。
体外肝脏模型，包括2D和3D肝细胞单一培养和共培养模型，在成本、伦理考虑和效率方面比动物模型具有优势。然而，2D肝细胞模型缺乏生理相关性，而3D肝细胞单一培养模型无法代表实质和非实质细胞之间的复杂相互作用。因此，模拟天然肝组织结构和细胞相互作用的3D共培养肝脏模型的开发为更准确地体外预测人类药物反应敏感性提供了潜力。以前常用的预测工具往往无法可靠地预测药物在人体中的疗效和毒性，导致药物开发中的高损耗率。3D细胞共培养肝脏模型可以更好地预测人类药物反应，并已在许多研究中用于预测候选或上市药物的体内代谢和清除。
在遵义医科大学基础药理教育部重点实验室、英国癌症研究中心曼彻斯特研究所的一项联合研究中，在讨论肝脏原代实质和非实质细胞的du;te结构和功能的基础上，分析了3D细胞共培养肝脏模型在药物研究中的潜在优势；然后介绍了3D细胞共培养肝脏模型中肝细胞的主要来源以及构建3D细胞共培养肝脏模型的常用方法；最后讨论了具有不同功能的3D细胞共培养肝脏系统及其应用。
肝脏的主要细胞成分及其功能
具有六边形结构的肝小叶构成了肝脏的基本结构和功能单位（图1）。中央静脉贯穿每个小叶的中心，负责运输肝内代谢物。小叶周围是门静脉三联体，由肝门静脉、肝动脉和胆管组成。肝门静脉将营养丰富的血液输送到肝脏，而肝动脉则向肝脏供氧。
肝细胞是肝脏中zui;fen;fu的细胞类型，它们形成从中央静脉向外辐射的肝细胞板。相邻的肝板之间所形成的腔隙，就是肝脏非常重要的生理解剖结构，即肝血窦。胆小管由两个邻近的肝细胞之间的间隙所形成，能够分泌、输送胆汁。肝小叶的结构和功能是由各种肝细胞之间复杂的相互作用所调节的。
图1 肝小叶结构示意图。
3D细胞共培养肝脏模型在药物评估中的潜在优势
3D系统可以是自聚集的细胞球体，由天然或合成材料制成的细胞外基质（ECM）样3D网络支架，以及使用3D技术构建的器官样系统，其具有氧气，营养物质和各种生物因子梯度和3D组织结构，可以发生细胞-细胞和细胞-ECM相互作用。这种培养模式更接近体内复杂的微环境，在很大程度上有助于改善体外肝细胞的功能活性。
然而，人们逐渐意识到，3D肝细胞单一培养模型忽略了肝组织中异型细胞的直接或间接信号交换。因此，整合肝异型细胞相互作用和3D微环境信号传导的3D共培养肝脏模型脱颖而出，具有许多优点。多项研究表明，在药物诱导的肝毒性、肝药物代谢和药物相互作用研究中，3D 细胞共培养肝脏模型比 2D 和 3D 单培养和 2D 共培养表现出更好的预测能力，因为 3D 细胞共培养中的细胞生长环境和异型细胞之间的信号调控使它们在体内表现出更相关的肝脏环境和表型，如可复制的肝窦结构、肝细胞活性和功能的长期维持、以及与肝脏特异性功能相关的基因表达的增加。Al Hrout等人构建的肝癌细胞和成纤维细胞的3D共培养模型，与肝癌细胞的2D或3D单培养相比，肝癌细胞发展相关的基因和蛋白质的表达增加，预后较差，且更接近肝癌在体内的发育特征，有助于更准确地评估体外抗癌药物的抗癌作用。总之，3D细胞共培养肝脏模型可有效提高肝细胞体外功能稳定性，保证体外药物预测结果的可靠性，有望为药物研究提供可靠的新平台。
3D细胞共培养肝脏模型的肝细胞来源
1. 原代肝细胞
原代肝细胞（PHs）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，动物和人源肝细胞都被使用。特别是原代人肝细胞（PHHs），由于其分泌特性和代谢酶活性与体内肝细胞相当，能够可靠地反映体内肝脏特性，因此在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究人员的青睐。然而，其功能特性的稳定表达高度依赖于微环境的信号调控，这意味着PHHs在单一的2D环境下会迅速经历表型变化、细胞活性下降和细胞膜极性丧失。为了增强PHHs的功能活性，有研究分别利用由Matrigel和3D生物打印模型组成的3D培养环境对PHHs的体外培养条件进行了改进。这些研究表明，PHHs可以维持其形态和功能数月，并改善对肝毒性药物的敏感性。
2. 肝癌细胞系
HepaRG、HepG2、Huh7和Hep3B是用于构建体外肝脏模型的常见肝细胞癌来源细胞系，因为它们易于获得、易于培养、增殖性高且表型稳定，与PHHs相比，供体间变异性较小。然而，这些细胞系的高增殖潜力通常伴随着低分化表型，这导致缺乏特定的肝功能，特别是在酶表达水平（特别是参与药物代谢的I期和II期代谢酶）、蛋白质和尿素合成方面，以及对毒性反应的敏感性远低于PHHs。
3. 干细胞
人诱导多能干细胞（HiPSCs）、胚胎干细胞（ESCs）和成体干细胞（ASCs），如间充质干细胞、肝脏干细胞和造血干细胞，在体外表现出强大的自我复制和自我更新能力。特别是HiPSCs和ESCs，在某些条件下具有分化成人体中几乎任何细胞类型的潜力。此外，HiPSCs可以从患者活检中获得，用于个性化研究。在全球肝脏供体稀缺的背景下，在特定条件下能够分化成肝细胞样细胞的干细胞可以作为肝病治疗，再生和体外建模的潜在资源.然而，干细胞在体外很难分化成功能成熟的肝细胞，并且可能存在免疫排斥和资源短缺等挑战。
3D细胞共培养肝脏模型的常用共培养方法
1. 直接 3D 共培养
直接3D共培养涉及将两种或多种不同类型的肝细胞混合成自组装球体，或在模拟天然肝组织结构的3D环境中将它们一起培养（图2）。直接 3D 共培养允许不同肝细胞之间的密切接触，从而通过直接细胞-细胞粘附、可溶性细胞因子的旁分泌、细胞-ECM 粘附和其他机制实现它们之间的信号通信。在像肝脏这样的多细胞器官中，异型细胞之间的直接接触在肝功能的充分发挥中起着重要作用。然而，在决定直接共培养的合理性时，重要的是要考虑体内肝组织中共培养细胞的实际分布。在体内通常没有直接接触的细胞类型的体外直接接触共培养可能是不必要的。此外，异型细胞之间的紧密连接也会影响细胞分离的难度，这对于需要单细胞类型分析的实验可能是不利的。因此，使用直接共培养的决定应基于共培养细胞的类型和实验目的。
图2 直接3D细胞共培养肝脏模型的示例。
（A）混合细胞球状共培养系统。（二）3D支架共培养。
2. 间接 3D 共培养
间接 3D 共培养涉及在具有物理分离系统的3D环境中培养两种或两种以上类型的肝细胞（图3），不允许存在于物理分离系统两侧的细胞之间直接接触，它们之间的信号通过可溶性细胞因子进行通信。物理分离系统的常见材料是Transwell细胞培养板和各种天然或合成材料。此外，一些研究人员还利用3D生物打印技术实现了HepG2和NIH/3T3成纤维细胞的间接3D共培养。他们证明，与HepG2的单培养相比，HepG2和NIH/3T3成纤维细胞的共培养表现出更好的肝细胞功能。间接共培养系统可以有效避免不必要的细胞接触，促进共培养异型细胞的分离，并可能成为研究体内非接触性肝细胞通讯的有前途的工具。
图3 间接3D细胞共培养肝脏模型的示例。
3D细胞共培养肝脏模型的类型
1. 增强肝细胞功能的3D细胞共培养模型
在肝组织中，肝细胞被LSECs 形成的肝窦网络包围，作为肝细胞内物质交换的基础，对维持肝细胞活性和功能稳态至关重要。LSECs和肝细胞的体外共培养已被证明能够实现血管化的3D肝组织结构，其中血管样管状网络的存在提供营养和氧气，以支持体外肝细胞的功能并维持代谢废物的消除。此外，LSECs可通过Id1通路诱导血管分泌因子Wnt2和肝细胞生长因子（HGF）上调，这两者都对肝细胞增殖至关重要。总之，在3D环境下，LSECs与肝细胞共培养可以重现体内肝窦的关键结构，这对体外增强肝细胞功能的研究具有重要意义。
2. 肝纤维化的3D细胞共培养模型
肝纤维化是一种肝脏疾病，其特征是肝脏中积累过多的细胞外基质蛋白。近年来开发了一系列与体内相关的3D细胞共培养肝纤维模型。体内肝纤维化受多种肝细胞调节，包括HSCs、肝细胞、LSECs 和KCs。然而，目前肝纤维化的共培养模型有限，只有少数研究报告了LSECs与HSCs、肝细胞和/或KCs的共培养，以建立肝纤维化的体外模型。因此，未来的研究必须将不同类型的肝细胞整合到3D环境中进行共培养，以构建更具代表性的肝纤维化体外模型。
3. 药物性肝损伤的3D细胞共培养模型
肝细胞由于其du;te的功能活性，通常被用作药物筛选模型的金标准。然而，KCs作为肝脏驻留巨噬细胞群的作用不容忽视，特别是在免疫介导的药物诱导性肝损伤中，因为它们具有有效的清除和吞噬功能。KCs在肝毒性反应中起着至关重要的作用，包含肝细胞和KCs的3D共培养系统有可能为未来临床前药物诱导的肝毒性评估提供更准确和有效的工具。然而，需要更多的研究来确认这些共培养系统在毒性药物筛选中的一般应用的功能特性。
总之，具有更复杂的细胞通讯和微环境特征的3D细胞共培养肝脏模型将成为未来药物开发和筛选研究的有力工具，提高体外药物评价数据的可靠性。解决肝细胞体外培养条件的挑战并进一步开发肝脏ECM样细胞培养系统和微流控芯片是朝着这个方向迈出的重要一步。
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