电转效率低？你可能忽略了这些

最近，总有小伙伴们前来询问在做完电转实验后，发现转染效率太低了该怎么办，于是小优通过搜集多方资料、询问技术专家，为大家找来了一些解决方案，下面我们就来一起看看吧～

一、什么是电转？

俗话说得好，知己知彼，方能百战百胜，所以首先我们需要清楚电转的原理。电转，也称电穿孔法，是通过脉冲电流在细胞膜上打孔，将外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）导入真核细胞内，来改变细胞的特性，从而达到改造细胞的目的，是实现细胞基因功能和蛋白质表达研究的重要工具。与其他细胞转染技术相比，电转具有操作简便、适用多种细胞、重复性好和转染效率高等优点。

二、影响电转效率的因素有哪些呢？

影响电转效率的因素有很多，总结下来有三方面：电转过程、细胞状态以及转染底物状态。只有了解影响电转效率的因素有哪些，我们才能够“对症下药”。

1.电转过程

1）电转的完整操作步骤包括电转前操作，电转执行和电转后培养。在进行电转前操作时，电转试剂、细胞与转染底物要进行混匀，如果混匀时过于激烈，会破坏转染复合物的形成，从而导致转染效率降低；

2）在进行电转前操作时，电击缓冲液的选择也很重要，由于细胞对缓冲液的离子组成和渗透压非常敏感，因此组分与细胞质类似的缓冲液有利于细胞电击后的存活；

3）电转执行时，需要控制电场强度和脉冲时间。适当提高电场强度或延长脉冲时间，能使底物更容易进入细胞，但细胞的死亡率也会增加。一般电场强度设置遵循低电场长时程的原则。如果选择内置优化程序的电转系统，如Lonza的Nucleofector系统，则可以节省摸索电场强度和脉冲时间的步骤。

4）转染培养基中含有抗生素会影响细胞转染效率，这是因为转染试剂对细胞有损伤，这时培养基中的抗生素会进一步损伤细胞，因此我们建议使用不含抗生素的培养基或PBS；

5）电转后培养要注意，如果使用传统转染试剂，转染后4-6h后必须进行换液，否则会由于转染试剂毒性而引起细胞死亡，最终影响转染效率。

2.细胞状态

1）细胞污染对细胞状态的影响很大，受到细菌、真菌或支原体污染的细胞都会导致转染效率降低、细胞死亡率增加，尤其是支原体污染悄无声息，因此一定要做好定期的支原体检测，确保细胞状态；

2）细胞培养到不同密度都能用于电转，但好的转化效率是在细胞的对数生长期（15代以内，传代后2d）。当细胞处于对数生长期时，有丝分裂较旺盛，表面结构密度比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA。

3.转染底物状态

1）不同的转染底物对转染效率都会产生不同的影响，例如质粒DNA在大小、用量以及构象这三方面都影响着电转效率，IRES导致转染效率低，转染mRNA需要调整洗涤次数等等；

2）转染试剂与底物的配比，也会影响转染效率，因此需要根据说明书或参考文献来进行配比优化实验，选用最佳配比浓度；

3）底物的内毒素，也会影响转染效率，内毒素含量过高，会导致转染过程中细胞状态变差，从而增加细胞死亡率，降低转染效率，因此要对内毒素进行控制。

三、如何提高电转效率？

我们都知道，电转的操作是需要借助仪器来完成的，因此除了要考虑上面的这些因素外，更重要的是选择一个高效的电转仪。Nucleofector™技术是Lonza公司的zhuan利创新技术，利用电击在细胞膜上开个小孔，综合各种特定细胞转染程序与转染液的作用，核酸底物不仅可以进入细胞质，还可直接通过核膜进入细胞核。相较于传统电转技术，Nucleofector™技术的细胞转染率可达99%，且实现转染不依赖于细胞的分裂。

01 Nucleofector™技术核心：核电转

利用特定的转染试剂和细胞保护剂，通过细微差别的电脉冲，使得转染物质不仅可以直接进入细胞质，而且可以直接通过核膜进入到细胞核。

注：图片来自Lonza

02 Nucleofector™技术组成

1）Nucleofector™设备：内置针对每种细胞优化好的转染参数。

2）配套试剂盒：试剂盒是包含有转染试剂，细胞保护剂，专用电极杯，吸管、pmaxGFP™阳性质粒。

3）数据库与操作手册：几百种细胞的详细的优化方案，不仅有转染步骤，也包含了核转染前后细胞的处理，如细胞来源、传代、生长条件、培养基以及转染后培养等细节技巧。

03 提高电转效率的方法

1.细胞收集时：

1)在消化贴壁细胞时，一定要注意终止胰酶反应，防止过度消化；最好使用专业的胰酶中和剂；

2)在进行细胞离心时，使用低转速长时间离心，提升细胞的存活率；

3)选择合适状态的细胞，一般原代细胞可以传1-2次后使用；尽量挑选迭代次数少的细胞，如果是冻存细胞，建议复苏1-2h后使用；

4)选择对数增长期的细胞；

5)做好支原体清除。

2.试剂添加：

1）电转试剂的添加只需室温操作即可；

2）细胞在试剂中停留不超20min，混合好尽快开始实验；

3）转染的底物占比不能大于总体积的10%，比如转染体系100ul，底物最多添加10ul；

4）在消化的细胞进行配置时，一定要离心并wan全去除残留培养基；

5）在加入到电极杯中时，要避免产生气泡，从而影响电脉冲；

6）对底物进行内毒素控制；

7）转染试剂与底物浓度配比控制；

8）如果是mRNA转染，可多洗涤2次。

3.程序设置：

1）使用Lonza电转仪，程序已经设定好，可以根据不同的细胞名称，选择对应的优程序； 根据实际情况，可以对程序进行微调，确保转染效率和细胞存活率。

2）使用需要自行设置的仪器，一般电场强度设置遵循低电场、长时程的原则。

4.细胞重悬：

1）转染结束之后，可以先停留10min再加培养基重悬；

2）使用无钙培养基重悬，5-10min后转移细胞到培养皿上；

3）后续的实验一般在转染后24h再进行；

4）电转后的细胞，铺板数量翻一倍。

5.转染后细胞的培养：选择表达高峰期细胞做实验，推荐文献可在Lonza查询。