真菌是一类具真核和细胞壁的异养生物。真菌可以通过孢子延续种群，典型的营养体为丝状分支结构。可污染细胞培养基的真菌种类繁多，最常见的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。
与其他类型的污染相比，真菌污染的症状明显不同且更易观察。
在培养基中会形成淡黄色或白色的漂浮物，肉眼可见，较易被发现；
短期内培养液多不变混浊；
显微镜下可以看见细胞之间或是培养基中，有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝；
多数菌丝在高倍镜下可以观察到链状排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散落在细胞上及细胞周边生长。
真菌污染的鉴定，需要将待检测的细胞培养基，接种在真菌专用培养基上进行鉴定，例如：马丁培养基、沙氏培养基等。
与处理细菌污染的原则一致，细胞培养物一旦发生真菌污染，建议舍弃培养物。应尽快把污染细胞与其它细胞系隔离开，不要打开培养皿，以免孢子飞出；同时需要对实验过程中所用的器材、试剂和操作空间做相应处理：消毒液喷洒、紫外线消毒、高温灭菌等。
如果细胞不能被丢弃，需要进行除真菌处理，请注意：高浓度的抗生素或是抗菌素（两性霉素 B 、泰乐菌素等）对细胞会产生一定毒性，在使用前可以进行剂量反应实验确定影响。
因此，发生真菌污染，尽量丢弃培养环境中的全部细胞。
