技术文章

一、概念

分子克隆技术是一种在分子水平上操作的技术，用于将特定的DNA片段从供体生物中分离出来，然后通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到适合的克隆载体中，并将重组克隆载体引入到合适的寄主体内进行复制与扩增。最终通过筛选、分离出所需的目的克隆载体，得到多拷贝的目的DNA，从而实现目的基因的扩增。

二、涉及研究领域

1. 分子克隆技术为许多研究领域提供了重要的方法和手段，以下是一些主要的研究领域：

①基因克隆和表达：分子克隆技术可以用于从供体生物中分离特定的DNA片段，然后将其插入到克隆载体中以实现目的基因的扩增和表达。这一技术对于研究和理解基因的功能以及开发新的基因疗法和药物至关重要。例如，可以研究基因表达产物的相互作用、蛋白质结构和功能等。

②病毒包装和基因治疗：通过分子克隆技术，科学家们可以创建含有特定病毒基因的重组载体，然后将其导入到宿主细胞中以产生病毒颗粒。这种技术被广泛应用于疫苗开发和基因治疗。

③细胞治疗和基因修饰：通过使用分子克隆技术，科学家们可以修改和修饰细胞基因组，从而改变细胞的特性和功能。这种技术对于研究疾病机制、开发新的细胞疗法以及生产具有特定功能的细胞系具有重要的应用价值。例如，通过CRISPR-Cas9等技术可以实现定点敲除、插入或替换特定基因；或者可以构建CAR-T细胞治疗肿瘤、干细胞治疗脊髓损伤等。

④蛋白质组学和生物大分子研究：分子克隆技术可用于创建含有特定蛋白质或生物大分子编码基因的重组载体，然后在宿主细胞中表达和纯化这些蛋白质或生物大分子。这种技术对于研究蛋白质的结构和功能以及开发新的药物和疗法具有重要意义。

⑤基因敲除和功能研究：通过使用分子克隆技术，可以创建含有特定基因敲除序列的重组载体，然后将它们导入到细胞中以删除目标基因。这种技术被广泛应用于研究基因的功能和确定特定基因在细胞生物学中的作用。例如，通过敲除小鼠或其他模式生物中的特定基因，可以研究该基因对生长发育、代谢等方面的作用。

⑥药物筛选和研究：利用分子克隆技术可以构建药物筛选模型，快速筛选出具有特定作用机制的药物。例如，可以构建突变体细胞系或模式生物，研究药物的作用机制和效果。

⑦农业和动物育种：分子克隆技术可以用于培育转基因作物和动物，提高产量、抗性以及生产高质量的农产品。此外，分子克隆技术还可以应用于动物育种，实现优良性状的基因组合。

2.应用举例说明

举例一：研究人类基因功能。若想要研究某个人类基因在细胞中的功能，可以使用分子克隆技术克隆该基因，并将其插入细胞中，观察基因表达对细胞功能的影响，从而揭示该基因的功能。

举例二：制备重组蛋白。若需要大量的特定蛋白用于实验或药物研发，可以使用分子克隆技术将目标蛋白的基因插入表达载体中，然后在宿主细胞中大量表达目标蛋白，并进行后续的纯化和功能研究。

举例三：改良作物品质。若想要改良某个作物的品质，可以使用分子克隆技术克隆与目标性状相关的基因，并将其插入作物基因组中，从而实现对作物品质的改良，例如提高作物的抗病性、产量和品质。

总结起来，分子克隆技术是一项重要的分子生物学技术，通过重组DNA分子，可以制备大量相同的DNA片段。它在基因研究、蛋白表达、基因治疗、农业改良和药物研发等领域有着广泛的应用。

三、实验步骤

1.获取目的基因片段：

①样本采样保存：为保证提取出的核酸质量优质且稳定，采样后应及时处理及妥善保存，以便于后续实验的成功。

②核酸提取

核酸提取是在分子生物学实验中从细胞或生物组织中分离并纯化核酸的过程。

以下是一些常见的核酸提取方法：

☆ 酚/氯仿抽提法：通过酚/氯仿处理细胞破碎液或组织匀浆后，在水相中主要溶解的是以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是脂类物质，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸，之后再离心分离和纯化溶解即可得到高纯度核酸。该法大优势是成本低，对实验条件要求较低，提取的核酸保持天然状态，获得的核酸纯度高、片段大、效果好。缺点是操作较为繁琐。

☆ 煮沸裂解法：适用于提取细菌质粒DNA。但得量少，杂质多，DNA可能会出现断裂，主要适用于一些粗略的实验。

☆ 碱裂解法：适用于提取质粒DNA。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。

☆ 层析柱法：通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，来分离纯化核酸。

☆ 热裂解碱法：碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离他们，在碱性下，变性蛋白是可溶的。

☆ 乙醇沉淀法：乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来，Na+等带正电荷离子能与磷酸基团结合，形成沉淀。

☆ 核酸提取仪：应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸提取工作的仪器。

以上方法仅供参考，实际操作中请依据具体情况选择。

③逆转录（此步骤仅限于提取的核酸为RNA时使用）

④PCR

以上内容请参考：分子技术#1、2、3、4

⑤凝胶电泳实验

☆ 实验需要准备材料：琼脂糖、缓冲液、DNA样品、DNA Marker、Loading buffer、核酸染料、核酸预制胶（若不自己配胶，可直接购买成品的预制胶）

☆ 实验设备：烧杯、量筒、天平、加热设备、电泳仪、电泳槽、制胶设备、移液器、吸头、凝胶成像系统、电脑

☆实验步骤

看凝胶电泳实验的实验视频

2.载体的选择

在分子克隆中，载体选择是非常关键的一步，因为它的性质和种类将直接影响实验的效率和结果。根据载体的性质和功能，可以将其分为以下几类：

按进入受体细胞的类型分类：

原核载体：原核细胞（如大肠杆菌）可直接摄取并表达重组体中的外源基因，因此原核载体常被用于原核细胞克隆。

真核载体：真核细胞（如酵母、哺乳动物细胞等）不能直接摄取重组体中的外源基因，但可以通过转化或转染等方法将重组体导入细胞中并表达外源基因，因此真核载体常被用于真核细胞克隆。

穿梭载体：穿梭载体既含有原核复制子，又含有真核复制子，可以在原核和真核两种宿主细胞中复制，并在真核细胞中有效表达。

按功能分类：

克隆载体：主要用于DNA克隆和扩增。它是一种可以接受外源DNA插入的DNA分子，通常包括质粒、噬菌体、宇宙中介病毒（Cosmid）等。例如，pUC19就是一种常用的质粒型克隆载体。通过将外源DNA插入到克隆载体中，然后在受体细胞内进行复制和扩增，可以获得大量的目标DNA分子。这在基因组学、基因克隆、DNA测序等方面的研究中具有重要作用。

表达载体：其更复杂，它不仅可以携带并复制外源基因的功能，还具有在宿主细胞中表达外源蛋白的功能。表达载体通常包含启动子和终止子等具有调控基因表达功能的序列。例如，pET系列表达载体可以在大肠杆菌中表达插入的外源基因，产生的蛋白质主要用于研究蛋白的功能、结构和相互作用等。表达载体的应用主要集中在基因表达调控研究、蛋白质相互作用研究、蛋白质结构与功能分析、基因治疗等领域。

总的来说，克隆载体和表达载体的主要区别在于：克隆载体主要用于获取大量目标DNA分子，而表达载体则主要用于在细胞内表达目标基因及其对应的蛋白质。这两种载体在基因工程和分子生物学研究中都有广泛的应用，但使用的目的和场景不同。

在具体选择载体时，需要考虑多种因素，如载体的来源、稳定性、拷贝数、插入片段大小、转化效率等。同时，还需要考虑实验的目的、所需的表达水平和宿主细胞类型等因素。在克隆和表达过程中，还应注意控制实验条件，确保数据的稳定性和可靠性。

3.目的基因与载体的酶切+连接

① 目的基因与载体的连接可以通过多种方法实现，以下是其中三种常用的方法：

粘性末端连接：将目的基因与载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶连接。这是常用的连接方式，连接效率高。

平端连接：将目的基因与载体切割成平端，用T4 DNA连接酶连接。这种方法需要使用高浓度的DNA和较长的连接时间。

人工接头连接：先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。

② 平末端和粘性末端在基因克隆过程中分别在不同的应用场景下使用

平末端：在基因克隆中，平末端通常是在限制性核酸内切酶识别位点处切割获得的。这种情况下，限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线处切开，产生的就是平末端。这种末端结构在自然界中很少出现，但在一些实验室技术中会使用。例如，在一些特殊情况下，例如进行基因敲除或同源重组等实验中，平末端可能会更有效。

粘性末端：相比之下，粘性末端通常是在限制性核酸内切酶识别位点处两侧切开获得的。这种情况下，限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开，产生的是粘性末端。这种末端结构在自然界中很少出现，但在一些实验室技术中常被使用，特别是在重组DNA技术中用于构建重组DNA分子。粘性末端可以与另一条DNA分子的粘性末端互相配对，形成连接，因此在进行DNA重组、连接反应时，通常会选择使用粘性末端。

总之，平末端和粘性末端各有其特点，分别适用于不同的情况。在基因克隆过程中，需要根据具体的应用场景来选择使用哪种末端结构。

③ 酶切+连接

△ 目的基因与载体的酶切和平/粘性末端连接步骤：

准备相关材料：目的基因、载体、不同的限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、缓冲液等。

对目的基因和载体进行酶切：根据实验设计，使用相应的限制性核酸内切酶对目的基因和载体进行酶切，产生相同的粘性末端或平末端。

进行连接反应：在连接缓冲液中加入适量的T4 DNA连接酶，将纯化后的目的基因与载体片段混合，进行连接反应，形成重组DNA。

4.重组DNA转化/转染/转导

①转化、转染和转导都是生物学中常用的术语，它们的含义和区别如下：

转化：主要应用于原核生物，如大肠杆菌。转化指的是将外源基因通过某些方式导入到原核细胞内，实现基因的转移。

转染：通常是指将核酸输送到真核细胞，有哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞等。比如将重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞内。转染是利用真核细胞的细胞膜结构特点，将外源基因导入到细胞内，是基因治疗、基因克隆等技术中的常用术语。

转导：是指一种特定类型的感染，主要发生在病毒感染的过程中病毒感染细胞后，可以通过病毒与细胞的相互作用将外源基因导入到细胞内，这种过程称为转导。

②重组DNA转化/转染/转导：将重组DNA转化/转染/转导进入大肠杆菌细胞、酵母菌细胞、植物外植体或动物细胞内。此后，宿主细胞会产生大量具有相同DNA序列的克隆细胞。

5.重组克隆细胞的筛选与鉴定

①目的：通过筛选和鉴定技术，确认宿主细胞中是否成功插入目标基因。

②方法

☆ 直接电泳检测法：从转化后的菌体克隆中分离质粒，进行电泳，通过比较其分子量进行筛选与鉴定。

☆ β-半乳糖苷酶显色法（蓝白筛选法）：将外源DNA克隆到含有编码α-半乳糖苷酶功能性亚基的lacZα序列的载体中，转化成具有lacZΔM15突变的特定大肠杆菌菌株，在提供的无色X-gal被β-半乳糖苷酶水解形成蓝色颜料，通过比较菌落颜色筛选鉴定出含有外源DNA的菌落。

☆ 正向选择向量：通过将DNA插入片段连接到克隆位点来破坏致死基因的表达。

☆ 限制酶酶切法：进行限制酶消化以确定正确的插入片段。

☆ 菌落PCR：也可以使用PCR筛选细菌菌落的方法来确定DNA插入物的存在。

6.重组克隆细胞扩增

①扩增：将成功插入目标基因的宿主细胞进行培养，使其快速繁殖，从而获得大量的含有目的基因的克隆细胞系。

②将成功插入目标基因的宿主细胞进行大量培养，可以通过以下步骤进行：

△ 选择合适的培养条件：根据宿主细胞的类型和特性，设置适合的生长条件，如温度、湿度、营养物质等。

△优化细胞培养基：细胞培养基是细胞生长和增殖的关键因素之一。通过添加生长因子、激素或其他必要物质，优化培养基，使其更适于目标细胞的生长和繁殖。

△采用适当的细胞传代方式：根据细胞的生长特性和需要，选择适当的传代方式。常用的传代方式有贴壁培养、悬浮培养等。

△细胞克隆和筛选：在初期，需要对细胞进行克隆和筛选，以获得能够稳定表达目标基因的宿主细胞系。

7.质粒提取

△ 目的：将宿主细胞内大量扩增的重组DNA片段提取出来，获得多拷贝的目的DNA片段。

以上是分子克隆的一般步骤，后续根据自己想要研究的领域（DNA测序、基因表达/调控/治疗/敲除、疫苗研发、药物筛选、动植物育种等），做后续的实验研究。