技术文章

 氧化型谷胱甘肽(GSSG)检测试剂盒(DTNB比色法)

产品货号：BA1827

产品规格：100T

产品简介：

谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在于几乎身体的每一个细胞，参与细胞许多功能活动，是一种氧自由基消除剂。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，保护组织细胞免受氧化损伤，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，故常简写为G-SH或GSH，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、铅、汞、砷等)等结合，具有整合解毒作用，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。谷胱甘肽是研究活性氧和自由基的重要指标，亦是机体氧化物牵累的重要指标。还原型谷胱甘肽 (GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，能可逆的转变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其存在形式会随着细胞内代谢的情况而发生相互转变。

氧化型谷胱甘肽(GSSG)检测试剂盒(DTNB比色法)(GSSG Assay Kit)是一种简单易行的GSSG检测的试剂盒，其检测原理是谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH，由GSSG还原成的GSH和样品本身含有的GSH都与发色底物DTNB反应，生成黄色的TNB和GSSG，总谷胱甘肽(T-GSH，GSSG+GSH)就相当于一个呈色的限速反应，T-GSH含量决定了黄色含量，用适当的方法先清除样品中的GSH，然后利用GR将GSSG还原成GSH，通过分光光度法检测412nm处吸光度，带入回归方程就可以计算出GSSG的量。该试剂盒可用于测定血浆、血清、植物或动物组织、细胞等样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，亦可检测总谷胱甘肽(T-GSH)含量。该试剂盒仅用于科研，不用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1. 离心管或小试管

2. 蒸馏水

3. PBS或生理盐水

4. 匀浆器或研钵

5. 低温离心机

6. 水浴锅

7. 比色杯

8. 分光光度计

操作步骤(仅供参考):

1. 配制GSH标准储存液：取10mg还原型谷胱甘肽(GSH)标准加入3.25ml ddH2O，溶解并混匀，即为还原型GSH标准储存液(10mM)；一部分立即使用，其余适当分装后-20℃保存。

2. 配制DTNB储存液：该本试剂盒提供的80mg DTNB中加入2ml DMSO，溶解并混匀，即为DTNB储存液(40mg/ml)；一部分立即使用，其余适当分装后-20℃保存。

3. 配制50×GSH还原酶：按GSH还原酶原液:GSH Assay Buffer=1:49的比例混合，即为50×GSH还原酶；-20℃保存，3个月有效。

4. 配制GSH 检测工作液：按下表配制GSH检测工作液。

5. 配制T-GSH检测工作液：按下表配制T-GSH检测工作液。

6. 配制蛋白沉淀工作液：在本试剂盒提供的2.5g蛋白沉淀剂中加入50ml ddH2O，配制成50ml 5%的水溶液，即为蛋白沉淀工作液，4℃保存。

7. 配制标准品：把还原型GSH标准储存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀释成50μM标准溶液，然后依次稀释成25、15、10、5、2μM GSH溶液，取50、25、15、10、5、2 μM GSH标准溶液6个点作标准曲线。注意：由于GSH标准在蛋白沉淀工作液中不太稳定，用蛋白沉淀工作液配制的GSH溶液必须新鲜配制后使用，不可冻存后再使用。

8. 配制NADPH工作液：在本试剂盒提供的10mg NADPH中加入1ml ddH2O，溶解并混匀，即为NADPH储存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余适当分装后-20℃保存。按0.1ml NADPH储存液(10mg/ml)加入8.23ml的比例加入GSH assay buffer，充分混匀，即为NADPH工作液(0.12mg/ml)。

9. 准备样品：

①红细胞或血浆样品：取新鲜血液，600g离心10min，沉淀为红细胞，上清为血浆。对于红细胞，用PBS洗涤两次，取约100μl红细胞沉淀或血浆，加入100μl蛋白沉淀工作液，充分Vortex振匀。4℃或冰浴放置10min，4℃ 10000g离心10min，取上清，用于GSSG测定，样品需暂时4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的红细胞样品最后需用蛋白沉淀工作液稀释10倍后再进行后续的测定，而对于血浆样品，应直接取80μl进行测定。

②植物或动物组织样品：取组织用液氮速冻迅速研磨，按每40mg加入100μl蛋白沉淀工作液 (亦可不用液氮，而是直接加入蛋白沉淀工作液至组织后匀浆或研磨)，充分Vortex振匀，再加入300μl蛋白沉淀工作液，用匀浆器充分匀浆。4℃孵育10min，4℃ 10000g离心10min，取上清，用于GSSG测定。样品需暂时4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天，对于处理好的组织样品通常需用蛋白沉淀工作液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常为5～20倍。

③细胞样品：PBS洗涤细胞1次，离心收集细胞，吸尽上清，加入细胞沉淀3倍体积的蛋白沉淀工作液，充分Vortex振匀(收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量，10mg细胞沉淀的体积可以粗略地看做10ml。)对样品进行快速的冻融后，4℃或冰上孵育5min，4℃ 10000g离心10min，取上清，用于GSSG测定。样品需暂时4℃保存备用，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天，对于处理好的组织样品通常需用蛋白沉淀工作液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常为5～20倍。

10. GSH加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的GSH浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

11. T-GSH加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的T-GSH浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

12. GSH和T-GSH测定：立即用分光光度计或自动生化分析仪测定410nm处吸光度，每隔2min测定1次，空白管调零，共检测6min(亦可加入NADPH工作液反应6min后检测，只检测1次)，以检测其反应速率ΔA/min。如果分光光度计不能测定410nm，可测定405～420nm处吸光度。

计算： 

①动力学测定法：根据不同时间点测定得到的吸光度计算出ΔA₄₁₀/min，以GSH标准的浓度(50、25、15、10、5、2μM)为横坐标，以ΔA₄₁₀/min为纵坐标，作出标准曲线，求出回归方程。根据待测的ΔA₄₁₀/min，对照标准曲线的回归方程可以计算出测定时测定时样品还原型谷胱甘肽(GSH)和总谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=总谷胱甘肽(T-GSH)的含量-还原型谷胱甘肽(GSH)含量

动力学法测定结果比终点测定法的结果精确，根据样品的稀释倍数、以及最初样品的使用量，可以计算出每毫克组织或细胞中的谷胱甘肽的含量，通过测定蛋白浓度，从而计算出样品的蛋白量，最后计算出每mg蛋白中还原型谷胱甘肽(GSH)和总谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

②终点测定法：即反应6min仅测定1次吸光度的方法。以GSH标准的浓度(50、25、15、10、5、2μM)为横坐标，以ΔA₄₁₀/min为纵坐标，作出标准曲线，求出回归方程，对照标准曲线的回归方程可以计算出测定时样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和总谷胱甘肽(T-GSH)的含量。终点测定法比动力学法快捷，根据样品的稀释倍数、以及最初样品的使用量，可以计算出每毫克组织或细胞中的谷胱甘肽的含量，通过测定蛋白浓度，从而计算出样品的蛋白量，最后计算出每mg蛋白中还原型谷胱甘肽(GSH)和总谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=总谷胱甘肽(T-GSH)的含量-还原型谷胱甘肽(GSH)含量

参考区间：

          成年全血GSH    1.02±0.17mmol/L

注意事项：

1. GSH比较稳定，血液样品以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3～4周内稳定。

2. 请尽量使用新鲜的细胞或血液进行测定，而不要使用冻存的细胞或血液进行测定，避免使GSH活性下降。

3. 全血GSH与吸烟和锻炼成正比。

4. 测定各管时，各孔温度均需达到室温或25℃，否则影响结果。

5. 轻度溶血样本对GSH测定无影响。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。