上海尚宝生物科技有限公司
2023/10/20 10:56:54乳酸含量（LA）检测试剂盒（可见分光光度法）
产品货号：BA1258
产品规格：50管/24样
产品简介：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH和H+，H+传递给PMS生成的PMSH2还原MTT生成紫色物质，在570nm处有特征吸收峰。
技术指标：
最di检出限：0.0387μmol/mL
线性范围：0.039-1μmol/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃ |
提取液二 | 液体4mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 液体60μL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂六 | 液体5mL×1瓶 | 4℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL的比例配制试剂二溶液，现用现配；
2. 试剂三：临用前加入12mL蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周；
3. 试剂四：临用前加12mL蒸馏水充分溶解，4℃保存一周；
4. 试剂五：临用前每瓶加入8mL蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存一周；
5. 标准品：临用前加入1.04mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液；
6. 显色液的配制：临用前根据用量按照试剂三（V）：试剂四（V）=1：1的比例充分混匀，现配现用。
需自备的仪器和用品：
天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、乙醇和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃12000g离心10min后取上清待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，4℃12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清（浆）：取100μL血清（浆）加入1mL提取液一，4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g离心10min后取上清待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，波长调至570nm，乙醇调零。
2. 标准液的稀释：将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为1、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039μmol/mL的标准溶液待测。
3. 加样表：
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
样本（μL） | 50 | 50 | - | - |
标准品（μL） | - | - | 50 | - |
蒸馏水（μL） | - | 10 | - | 50 |
试剂一（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂二（μL） | 50 | - | 50 | 50 |
试剂五（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
在EP管中充分混匀，于37℃水浴准确反应20min。 | ||||
试剂六（μL） | 30 | 30 | 30 | 30 |
显色液（μL） | 300 | 300 | 300 | 300 |
37℃避光反应20min后于25℃，10000rpm离心10min，去上清，留沉淀。 | ||||
乙醇（μL） | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分溶解沉淀后，于570nm处测定吸光值，分别记为A测定管，A对照管，A标准管，A空白管，计算ΔA测定=A测定管-A对照管；ΔA标准= A标准管-A空白管。 | ||||
三、乳酸含量的计算
1. 标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（ΔA标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入公式中得到x（μmol/mL）。
2. 乳酸含量计算
（1）按照蛋白含量计算
LA含量（μmol/mg prot）=x×V样本÷（V样本×Cpr）=x÷Cpr
（2）按照样本质量计算
LA含量（μmol/g质量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W
（3）按照细胞数量计算
LA含量（μmol/106 cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（5×V上清÷V提取液一）=0.2375×x
（4）按照液体体积计算
LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]=13.0625×x
V样本：加入的样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测 定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；5：细胞数量，5×106个；V液体：液体样本体积，0.1mL。
注意事项:
如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
