中华人民共和国国家标准
GB/T 22260-2023
代替GB/T 22260-2008
饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of anabolic steroids in feeds-
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T 22260-2008《饲料中甲基睾丸酮的测定 高效液相色谱串联质谱法》，与
GB/T 22260-2008 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：
a）增加了检出限（见第1章）；
b）更改了原理（见第4章，2008年版的第3章）；
c）更改了试样的提取和净化（见8.1、8.2，2008年版的7.1、7.2）；
d）更改了液相色谱和质谱参考条件（见8.3.1和8.3.2，2008年版的7.3.1和7.3.2）；
e）更改了液相色谱-串联质谱法定性和定量要求（见8.3.4和8.3.5，2008年版的7.3.3）；
f）更改了试验数据处理（见第9章，2008年版的8.1）；
g）更改了精密度（见第10章，2008年版的第9章）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。
本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、中国农业科学院饲料研究所。
本文件主要起草人：黄士新、王博、谷旭、曹莹、张婧、严凤、商军、吴剑平、贾铭、王杰、李军国、张文刚、黄家莺。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——2008 年首次发布为GB/T 22260-2008；
——本次为第一次修订。
1范围
本文件描述了饲料中蛋白质同化激素的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中睾酮、甲基睾丸酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮、黄体酮的测定。
本文件甲基睾丸酮、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮的检出限为0.005mg/kg，睾酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、黄体酮的检出限为0.02mg/kg；甲基睾丸酮、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮的定量限为0.01 mg/kg， 睾酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、黄体酮的定量限为0.05 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20195动物饲料 试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中的蛋白质同化激素用乙腈提取，经吸附剂净化后，用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。
5试剂或材料
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2 乙腈：色谱纯。
5.3甲酸：色谱纯。
5.4 50%乙腈溶液：取50 mL乙腈（5.2），加水稀释至100 mL，混匀。
5.5 0.01%甲酸溶液：取100 μL甲酸（5.3），加水稀释至1 000 mL，混匀。
5.6标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取睾酮、甲基睾丸酮、勃地龙、美雄酮、雄烯二酮、脱氢异雄酮、诺龙、丙酸诺龙、司坦唑醇、醋酸美伦孕酮、黄体酮各0.01 g（精确至0.000 01 g），分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）溶解并定容，混匀。于-18℃以下保存，有效期为6个月。蛋白质同化激素标准品等具体信息见附录A。
5.7混合标准中间溶液I（10μg/mL）：分别准确移取标准储备溶液（5.6）各100μL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）稀释、定容，混匀。于-18℃以下保存，有效期为3个月。
5.8 混合标准中间溶液II（1μg/mL）：准确移取混合标准中间溶液I（5.7）1 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）稀释、定容，混匀。临用现配。
5.9同位素内标储备溶液（1 mg/mL）：称取睾酮-D3、甲基睾丸酮-D3、勃地龙-D3、美雄酮-D3、雄烯二酮-D7、脱氢异雄酮-D2、诺龙-D3、丙酸诺龙-D3、司坦唑醇-D3、醋酸美伦孕酮-D3、黄体酮-D9各0.01 g（精确至0.00001 g），分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）溶解并定容，混匀。于-18℃以下保存，有效期为6个月。同位素内标标准品等具体信息见附录A。
5.10同位素内标混合标准中间溶液I（10μg/mL）：分别准确移取同位素内标储备溶液（5.9）各100μL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）稀释、定容，混匀。于-18℃以下保存，有效期为3个月。
5.11 同位素内标混合标准中间溶液II（1μg/ml）：准确移取同位素内标混合标准中间溶液I （5.10）1 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.2）稀释、定容，混匀。临用现配。
5.12混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液II（5.8）于棕色容量瓶中，加入适量同位素内标混合标准中间溶液II （5.11），用50%乙腈溶液（5.4）稀释、定容，混匀，配制成质量浓度分别为1.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/ mL、20.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL混合标准系列溶液，同位素内标质量浓度均为10ng/mL。临用现配。
5.13 微孔滤膜：0.22μm，有机系。
5.14 吸附剂：乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），粒径40μm，或性能相当者。
6仪器设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 天平：精度0.00001 g和0.001 g。
6.3涡旋振荡器：转速不低于1 500 r/ min。
6.4 离心机：转速不低于9 000 r/ min。
6.5 涡旋混合器。
6.6氮吹仪。
7样品
按GB/T 20195制备样品，至少200 g，粉碎使其全部通过0.425 mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，备用。
8试验步骤
8.1 提取
平行做两份试验。称取试样1 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入100 μL同位素内标混合标准中间溶液II （5.11）、20 mL乙腈（5.2），涡旋混匀1 min，1 500 r/min 涡旋振荡提取20 min，9 000 r/min离心5 min，上清液备用。
8.2 净化
移取3 mL上清液（8.1）于50 mL离心管中，加入100 mg PSA粉，涡旋1 min，9 000 r/min离心5 min，准确移取2 mL上清液于50℃下用氮气吹干，准确加入1 mL50%乙腈溶液（5.4），涡旋混匀，过膜（5.13），待测。
8.3 测定
8.3.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C18柱，长100 mm，内径2.1 mm，粒径2.6 μm，或性能相当者；
b）流动相：A相为乙腈（5.2），B相为0.01%甲酸溶液（5.5），梯度洗脱程序见表1；
c）流速：0.3 mL/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：10μL。
8.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源模式：电喷雾电离源；
b）扫描方式：正离子；
c）监测方式：多反应监测（MRM）；
d）电离电压：3.0 kV；
e）源温度：150℃；
f）鞘气：800 L/h；
g）反吹气：50 L/h；
h）雾化器温度：500℃。
多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。
8.3.3标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.12）和试样溶液（8.2）上机测定。混合标准溶液的特征离子质量色谱图见附录B。
8.3.4定性
在相同试验条件下，试样溶液与标准系列溶液（浓度相当）中蛋白质同化激素色谱峰的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的监测离子对，比较试样谱图中蛋白质同化激素监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中监测离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在此蛋白质同化激素。
8.3.5 定量
以蛋白质同化激素标准溶液浓度为横坐标，蛋白质同化激素与同位素内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液（8.2）中蛋白质同化激素的响应值应在标准曲线线性范围内。如超出范围，应重新试验。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。
9试验数据处理
试样中待测物的含量以质量分数ωi计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按公式（1）计算，单点校准按公式（2）计算：
式中：
ρ——由标准曲线得到的试样液中蛋白质同化激素的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V3——试样的最终定容体积，单位为毫升（mL）；
V2——用于氮吹的上清液体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
式中：
A——试样溶液中蛋白质同化激素的峰面积；
ρs——标准溶液中蛋白质同化激素的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A’is——标准溶液中蛋白质同化激素同位素内标的峰面积；
ρis——试样溶液中蛋白质同化激素同位素内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V3——试样的最终定容体积，单位为毫升（mL）；
As——标准溶液中蛋白质同化激素的峰面积；
Ais——试样溶液中蛋白质同化激素同位素内标的峰面积；
ρ’is——标准溶液中蛋白质同化激素同位素内标的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V2——用于氮吹的上清液体积，单位为毫升（mL）；
m——试样质量，单位为克（g）。
测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。
