目前有多种方法可以将基因导入真核细胞内，一般可分为病毒类载体技术和非病毒类载体技术，后者具有低毒性和低免疫反应的特点，且不受细胞或种属特异机制和导入片段大小等限制的优势。其中，电穿孔法以其较高的转染率而备受关注。电穿孔法是应用短暂的高压电流脉冲诱导活细胞产生跨膜电位，由于外加电场强度大于细胞膜穿孔的临界值，引起细胞质膜结构暂时性改变，形成纳米级微孔，DNA等外源物质通过这些微孔进入细胞质或细胞核。
大多数细胞通过传统转染技术就可以提高转染效率，而原代细胞、免疫细胞、神经细胞、干细胞等难以通过传统方法获得高转染效率，成为困扰科研人员的难题。NEPA GENE公司在细胞转染和融合领域拥有超过二十年的研究经验，其代表产品NEPA21高效基因转染系统自上市以来受到了国内外众多科学家的青睐。在干细胞转染方面，如iPS、ESC、HSC和MSC等细胞，NEPA21均被研究者们用于转染实验中，积累了丰富的转染条件、细胞转染效率和基因编辑效率等宝贵的经验和数据。
案例一 使用NEPA21电转染仪将mRNA导入hESC
参考文献：Gene Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by In Vitro-Synthesized mRNA for Gene Therapy
转染物质：GFP / DsRed mRNA
电转参数：电压125V（文中只写明电压，详细参数可咨询）
在本研究中，作者通过体外转录合成多种类型的mRNA，使用NEPA21电转仪将其导入到hESC中，以研究mRNA在hESC中的转染效率和诱导蛋白表达的时间（图1）。同时，为了保证转染效率对HN4细胞系不具有特异性，作者对多种hESC细胞系和iPS的转染效率进行了比较。在电穿孔24h后，FCAS分析显示，GFP mRNA在HN4、NS1、NS2和iPS中表达量均在95%以上（图1）。
图1 电穿孔24h后，GFP在不同细胞系中的转染效率
在电穿孔后，是否能维持胚胎干细胞的多能性仍需要进一步的检测。在此，研究人员通过免疫荧光法检测了两种常见的标志基因（Oct4和SSEA4）。结果显示，转染24h后，大多数表达GFP的细胞仍然呈Oct4阳性和SSEA4阳性。
图2 电穿孔24h后，HN4细胞中Oct4和SSEA4基因的表达
此外，研究人员还证明采用电穿孔法可以有效地将GFP和DsRed mRNA共转染至HN4细胞中（图3）。
图2 GFP和DsRed mRNA共转染
案例二 使用NEPA21进行iPSC电转及基因编辑（CRSIPR/TALENs）
参考文献：
1.Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9.
2. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system
转染物质：EGFP质粒、敲除实验（TALENs: 5μg left + 5μg right或CRISPR: 5μg Cas9 + 5μg sgRNA）、敲入实验（5μg donor vector + TALENs（5μg left + 5μg right）或CRISPR（5μg Cas9 + 5μg sgRNA））
电转参数：电压125V、脉冲时长5ms、脉冲次数2
为了在iPS细胞中获得最高的质粒转染效率，研究人员使用EGFP质粒转染了3种iPS细胞系（201B7、404C2、DMD-iPSC），优化脉冲电压、脉冲时间等转染条件。结果如下图所示：
图4 iPSC转染条件优化
使用NEPA21优化转染条件之后，通过TALEN和CRISPR两种方法对iPSC的DMD基因进行敲除和敲入实验，基因编辑效率如下：
Knockout：
图5 iPSC基因敲除效率
Knockin：
图6 iPSC基因敲入效率
案例三 使用NEPA21进行HSC转染条件优化及基因编辑（CRISPR）
参考文献：Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9
转染质粒：CRISPR/RNP
电转参数：穿孔参数（电压100V、脉冲时长5ms、脉冲次数8）、转移参数（电压10V、脉冲时长50ms、脉冲次数5），本文使用1mm间隔电转杯
在这项研究中，研究者旨在通过连续移植来评估真正的HSCs的基因组编辑效率。为了避免病毒整合到HSC基因组中，采用了非病毒转染方法（电穿孔）来编辑小鼠HSC的基因组。首先通过电穿孔将Cas9/RNP转移到体外的HSC中，随后通过三次细胞移植来检验真正的HSC的敲除效率。此外，通过基因插入，还成功地证明了对小鼠HSCs中X-SCID突变的基因校正，从而治愈了小鼠。
研究人员首先以GFP为报告基因，通过NEPA21在小鼠骨髓系阴性细胞（Lin-）中优化了电穿孔条件，并通过GFP荧光和7-氨基-放线jun素D（7-AAD）染色检测细胞转染效率和细胞存活率。结果显示，在电压100V、脉冲时间5ms、脉冲次数8次的电转条件下，细胞转染效率>60%，存活率>50%，可作为后续实验的电穿孔参数（图7）。
图7 HSC转染效率
随后，将针对Itga2b基因外显子1和2的RNP复合体电穿孔转染至Lin-细胞。在体外培养1~2周后，通过Surveyor实验检测到Itga2b外显子1和2的突变，并且将基因编辑后的Lin-细胞通过连续移植后仍能检测到15%定点突变效率，证明了基因编辑发生在真正的HSC中（图8）。
图8 在HSC中敲除Itga2b结果
为了恢复X-SCID小鼠的IL2RG基因功能，研究者采取了基于NHEJ和同源无关的靶向整合（HITI）的策略，将IL2RG外显子2-8（HITI-cDNAex2-8）整合到IL2RG的内含子1。他们先在NIH3T3细胞中测试了该方法，通过NEPA21电转仪导入IL2RG内含子1的gRNA与Cas9（Cas9/RNP-Il2rgin1），在NIH 3T3细胞中有效地产生了43.1%的突变。基于此，进一步检测了在Lin-细胞中的基因插入效率，通过Surveyor分析和扩增序列测定，细胞基因突变效率为20.2%（图9）。
图9 在HSC中对IL2RG基因插入结果
本文中提到，Cas9/RNP通过电穿孔到造血干细胞，可以不使用任何病毒载体，基因编辑技术为基因位点的特异性修饰提供了可能。非整合病毒如腺病毒或腺相关病毒（AAV）经常被用来传递CRISPR/Cas9，但它们会在宿主中激发对组成性表达的Cas9的免疫反应。相反，Cas9/RNP在转导细胞中迅速降解，从而逃避宿主的免疫反应，更重要的是，电穿孔与其他传递方法相比，产生的脱靶DSB更少。
案例四 使用NEPA21电转MSC的最佳条件
参考文献：电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件
转染物质：EEV-EGFP质粒
电转参数：电压150V、脉冲时长5ms、脉冲间隔50ms、脉冲次数2
本文采用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入华通胶间充质干细胞（WJ-MSC），并通过流式细胞仪检测转染率，以探讨不同电穿孔条件对WJ-MSC转染效率的影响，确定最佳电转染条件。
研究人员测试了不同电压（125，130，140，150，170V）、不同脉冲时间（2.5，5.0，7.5ms）、不同细胞状态（体积分数为20%正常氧、体积分数为5%低氧）对WJ-MSC电转染效率的影响。电穿孔后48h进行检测，转染质粒携带EGFP绿色荧光标签，转染成功的WJ-MSC将表达绿色荧光蛋白，使用流式细胞仪检测荧光表达率。
结果表明，正常培养的WJ-MSC在电压150V、脉冲时长5.0ms、脉冲间隔时间50ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率。
图10 不同转染条件下WJ-MSC的转染效率
总结
较高的电穿孔条件可以更有效地编辑基因组，但会对细胞造成较大损伤，而较弱的电转染条件对细胞更温和，但细胞转染效率和编辑效率可能较低。因此，为基因组编辑效率和细胞活力找到一个可接受的条件是十分重要的。NEPA21采用全新四步法电转程序，可对细胞穿孔模式和基因转移模式中的所有参数进行单独设置（电压、脉冲时长、脉冲间隔、脉冲次数和衰减比例），非常有利于难转染细胞的参数优化，提高转染效率。
NEPA21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，配合电压衰减设计，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。操作简单，电转参数可见可调，适用性强。特别适用于难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、外泌体、类器官、活体动物、受精卵及宫内胚胎等的转染，已应用于众多著名期刊文献中，是进行细胞悬浮/贴壁状态、活体和离体组织转染的电转系统主流品牌之一。
本文引用的案例均为已发表文献，想了解NEPA21更多应用案例或实验细节可咨询。
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