PICK ME UP！干细胞挑取的C位技术

CRISPR / Cas9编辑系统目前被广泛应用于在hPSCs（多能干细胞）的特定基因中产生突变，以此模拟体外遗传疾病的细胞模型。转染后的混合细胞群同时包含未编辑和各种编辑的细胞，需要通过手动稀释克隆进行分离，这个过程既费时又费力，而且步骤繁琐。

最近一篇文章^[1]利用赛多利斯CellCelector Flex全自动无损细胞分离系统在CRISPR / Cas9基因编辑后，从混合细胞群中高效识别单细胞，并从这些分离的单细胞中精确分离单细胞克隆。那么，这个设备有什么秘密呢？

秘密1 纳米孔板：让细胞住上单间

24孔板中的每一个大孔都具有数千个方形纳米孔（体积约为4 nL的微结构）。在这种设计下，纳米孔的存在可以增加孔内的细胞密度，同时确保单个细胞能通过纳米孔壁有效地分离。这使得数几千个细胞能够在同一大孔中共培养，同时保持其单克隆性，并且拥有更快的增殖速度。每个大孔只需要接种约1000-3000个细胞，接种细胞按照泊松分布随机分布在纳米孔中，因此，至少约30%的纳米孔会被单细胞占据，从而大大提高单细胞的分离效率。

 

 

图1. CellCelector Flex全自动无损细胞分离系统和24孔纳米孔板：

A.每个纳米孔形成一个正方形（200×200 μm），由100 μm高的壁界定；

B. 系统能自动拼接整个孔图像并自动分割纳米孔，在每个代表性孔中，软件能通过分割识别2,263个方形纳米孔，每个识别的纳米孔都用红线包围，并分配一个唯一ID，以便在实验中实现可追溯性；C. CellCelector Flex 概述：（a） 倒置荧光显微镜和电动载物台;（b）终板工作台和（c）带有高精度玻璃毛细管的单细胞挑取机械臂（放大视角见图D.）；

E. 系统俯视图：平台由专用区域组成，（a）源板工作台（b）灭菌罐和（c）废物容器

 

秘密2自动识别单克隆孔

为了验证该系统识别、筛选和挑取hPSC克隆方面的能力，文中生成了两个具有整合GFP或mCherry基因的hPSC细胞系，并将转基因插入到腺相关病毒整合位点1（AAVS1）位点。以等比例混合无标记，分别表达GFP和mCherry的hPSC，然后将它们接种到纳米孔中。在D0（第0天），使用CellCelector Flex系统自动扫描接种了细胞的纳米孔。然后使用CellCelector Flex软件的特定图像分析算法（包括设定单细胞大小和球形度等参数阈值）对D0的单细胞纳米孔进行鉴定。在挑选前的第3-5天，我们再次扫描纳米孔板，系统会根据其生长自动选择单细胞来源的细胞克隆团，并提供基于图像的单克隆证明。文章使用CellCelector Flex玻璃毛细管挑头对细胞克隆团进行挑取，并将其接种在96孔板中。在培养过程中，可以使用Incucyte® 实时活细胞分析系统跟踪细胞的生长。

秘密3 温和挑取细胞，无交叉污染

文章中作者还探究了单细胞挑取过程中大家最为关心的交叉污染问题。由于玻璃毛细管在每次取样之间不会更换，设计实验评估了使用同一毛细管连续取样和接种细胞克隆团是否会导致交叉污染。连续挑取无标记、GFP 或 mCherry 荧光的细胞克隆团并接种。细胞增殖后，在接种孔里没有观察到细胞克隆团的荧光颜色混合。因此，连续提取不同的细胞克隆团不会引起交叉污染。并且几乎所有挑取接种后的培养孔里的细胞克隆团都进行了增殖，也说明挑取和接种不会影响细胞活性。

文章最后用免疫荧光观测和测序验证了挑取后干细胞的多能性和基因整合度。

这样的系统，做干细胞的你怎能不爱？