一、封闭
1.涡旋Duolink®封闭液。
2.在每个1cm2样品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封闭液。确保封闭液要覆盖整个样品。
3.将载玻片置于加热湿度箱中37℃孵育60分钟。
二、孵育一抗在添加抗体之前请勿让载玻片干燥，否则会导致背景。
1.涡旋Duolink®抗体稀释剂。
2.在Duolink®抗体稀释剂中稀释一抗或抗体至合适浓度。
3.从载玻片上弹掉Duolink®封闭液
4.将一抗溶液添加到每个样品中。
5.将载玻片置于湿度箱中孵育。用最佳孵育温度和时间孵育一抗。
三、孵育Duolink® PLA探针
1.涡旋PLUS和MINUS PLA探针
2.在Duolink®抗体稀释剂中以1:5稀释PLUS和MINUS PLA探针。
对于40 μL反应，取8 μL PLA探针MINUS原液，8 μL PLA探针PLUS原液和24 μL抗体稀释剂。为所有样品制备足量的溶液。
3.从载玻片移除一抗溶液
4.在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
5.移除多余的洗涤缓冲液，然后涂抹PLA探针溶液。
6.将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育1小时。
四、连接
说明：连接酶要等到需要添加到样品中时立即添加。确保连接缓冲液在使用前解冻并充分混合。
1.用高纯度纯水以1:5稀释5x Duolink® 连接缓冲液并混合。
对于40 μL反应，将8 μL 5x连接缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。为所有样品制备足量的溶液。
2.从载玻片移除PLA探针溶液。
3.在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
4.在洗涤过程中，使用冷冻座（-20°C）恢复从冻箱里取出的连接酶。
5.以1:40稀释度将连接酶添加到步骤（a）中的1x连接缓冲液中，并混合。
对于40 μL连接溶液，将1 μL连接酶添加至39 μL的1x连接缓冲液中。
6.移除多余的洗涤缓冲液，然后涂抹连接溶液。
7.将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育30分钟。
五、扩增
说明：聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。扩增缓冲液对光敏感。避免所有含有扩增缓冲液的溶液受到光照。
1.用高纯度纯水将5x扩增缓冲液以1:5稀释并混合。对于40 μL反应，将8 μL 5x扩增缓冲液添加到32 μL高纯度纯水中。为所有样品制备足量的溶液。
2.从载玻片移除连接溶液。
3.在室温下在1x洗涤缓冲液A中洗涤载玻片2x 5分钟。
4.在洗涤过程中，使用冷冻座（-20°C）恢复从冻箱里取出的聚合酶。
5.以1:80稀释度将聚合酶添加到步骤（a）中的1x扩增缓冲液中，并混合。
6.移除多余的洗涤缓冲液，然后涂抹扩增溶液。
7.将载玻片置于预热的湿度箱37℃孵育100分钟。
六、最终洗涤
说明：光敏试剂。始终避免保存载玻片。
1.从载玻片上移除扩增溶液。
2.在室温下在1x洗涤缓冲液B中将载玻片洗涤2x 10分钟。
3.在0.01x洗涤缓冲液B中洗涤载玻片1分钟。
七、准备成像
说明：含DAPI的Duolink原位封固剂是水性的，不会凝固。可用干净的指甲油密封盖玻片和载玻片的边缘。避免在盖玻片下制造气泡。
1.拍掉载玻片上多余的洗涤缓冲液。
2.使用最小体积的含DAPI的Duolink原位封固剂，用盖玻片盖好载玻片。
3.等待15分钟，然后在荧光或共聚焦显微镜中分析，使用至少20x物镜。
4.成像后，可将载玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6个月。
